噻托溴銨調(diào)控MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

李 妮,張 靜

(1.銅川礦務(wù)局中心醫(yī)院藥劑科,陜西 銅川 727000; 2.空軍第九八六醫(yī)院藥劑科,西安 710054)

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病[1]。其特征是炎癥、可逆性氣道阻塞、高反應(yīng)性和氣道重塑。常見癥狀包括喘息、咳嗽、胸悶和呼吸困難,這是由遺傳和環(huán)境因素共同引起的[2-3]。氣道重塑是哮喘的主要特征之一,其特征是氣道壁厚增加,因此,氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)的異常增殖被認(rèn)為有助于氣道重塑[4]。血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB是一種細(xì)胞分裂素,是刺激多種細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,并可誘導(dǎo)ASMCs的增殖和運(yùn)動(dòng),最終導(dǎo)致哮喘。因此,研究氣道重塑和ASMCs增殖機(jī)制對(duì)哮喘的防治具有重要意義。

支氣管收縮引起的機(jī)械力可能在哮喘的氣道重塑中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。GRAINGE等[7]發(fā)現(xiàn),在沒有炎癥的情況下,支氣管收縮會(huì)導(dǎo)致哮喘患者的氣道重塑。而抗膽堿能藥物的治療作用可能超過支氣管擴(kuò)張藥。噻托溴銨(tiotropium)是一種長(zhǎng)效吸入毒蕈堿拮抗劑,有研究[8]表明,噻托溴銨能夠抑制豚鼠哮喘模型中的氣道重塑,而噻托溴銨抑制氣道重塑的潛在機(jī)制尚未明確。據(jù)報(bào)道[9],NF-κB/MAPK信號(hào)通路在哮喘的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。因此,本研究構(gòu)建PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs,提出噻托溴銨通過MAPK/NF-κB途徑影響ASMCs增殖和侵襲的假設(shè),并進(jìn)一步研究其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制,證實(shí)噻托溴銨可以作為一種治療哮喘的有前途的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

人ASMCs(江陰齊氏生物科技有限公司),DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)invitrogen公司),PDGF-BB、噻托溴銨(美國(guó)Sigma公司),CCK-8檢測(cè)試劑盒(中國(guó)Beyotime公司),微型平板光譜儀(美國(guó)Bio-Rad公司),Boyden Transwell室(美國(guó)Corning公司),100%Matrigel(美國(guó)BD Biosciences公司),PVDF膜(美國(guó)Millipore公司),兔抗人MMP-2、MMP-9、calponin、α-SMA、p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB、p-p62、GAPDH(英國(guó)Abcam公司),二抗山羊抗兔IgG(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人ASMCs接種在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。PDGF-BB處理:將PDGF-BB以10 ng·mL-1的質(zhì)量濃度加入到ASMCs中24 h。噻托溴銨以10 mmol·L-1的濃度溶解在二甲亞砜(DMSO)中作為儲(chǔ)存溶液。

1.3 細(xì)胞增殖能力分析

使用CCK-8檢測(cè)試劑盒測(cè)量ASMCs的活力。將ASMCs細(xì)胞接種到96孔板中,并在37 ℃下在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。使用10 ng·mL-1PDGF處理或使用不同濃度(0、5、10、20、50 μmol·L-1)噻托溴銨處理后,將細(xì)胞從培養(yǎng)基中移除,并在37 ℃下暴露于CCK-8試劑1.5 h。在450 nm下用微型平板光譜儀評(píng)估相對(duì)細(xì)胞活力。

通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將PDGF-BB處理后的ASMCs細(xì)胞(1×103細(xì)胞·孔-1)接種到六孔板中,并在含有10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。用甲醇固定菌落,并用0.1%結(jié)晶紫染色。使用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的菌落。

1.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)孔中生長(zhǎng)約70%～80%時(shí),使用200 μL移液管尖端輕輕在培養(yǎng)皿底部劃出一條橫線。用PBS短暫洗滌2次以除去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片,加入新鮮的無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,后在顯微鏡上拍照,計(jì)算ASMCs細(xì)胞的遷移率。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):將在無血清培養(yǎng)基中收獲的轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于Boyden Transwell室的上室。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種在預(yù)涂有100%Matrigel的上室中。將含有10%FBS的完整培養(yǎng)基用作化學(xué)引誘劑添加到下腔室中。用棉簽輕輕去除殘留在上表面的細(xì)胞,固定位于下腔室的細(xì)胞,用結(jié)晶紫染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)MAPK/NF-κB信號(hào)通路的水平。用RIPA緩沖液在冰上裂解ASMCs細(xì)胞,后于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,并用5%脫脂奶封閉。在4 ℃加一抗兔抗人MMP-2、MMP-9、calponin、α-SMA、p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB、p-p62、GAPDH,隨后用二抗山羊抗兔IgG孵育1 h,用ImageJ軟件獲取數(shù)據(jù)并計(jì)算。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

用人VEGF ELISA試劑盒評(píng)價(jià)細(xì)胞上清液中VEGF的濃度。通過以13 000 r·min-1和4 ℃離心10 min收集上清液。然后用ELISA法測(cè)定VEGF的濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad 8.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均值±3次獨(dú)立重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 噻托溴銨抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs活力和增殖

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度噻托溴銨處理的各組ASMCs細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明在這些濃度下使用噻托溴銨不會(huì)損害細(xì)胞活力(圖1A)。與對(duì)照組相比,PDGF-BB刺激顯著誘導(dǎo)ASMCs生長(zhǎng)約30%(P<0.05)。噻托溴銨處理以劑量依賴的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中的細(xì)胞生長(zhǎng),在20 μmol·L-1的濃度下抑制顯著(P<0.05)(圖1B)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示噻托溴銨處理以劑量依賴的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中的細(xì)胞增殖能力(圖1C—D)。

A:不同濃度噻托溴銨處理的各組ASMCs細(xì)胞活力比較;B:10 ng·mL-1PDGF處理或不同濃度(0、5、10、20、50 μmol·L-1)噻托溴銨處理ASMCs細(xì)胞活力比較;C、D:10 ng·mL-1PDGF處理或不同濃度(0、5、10、20、50 μmol·L-1)噻托溴銨處理ASMCs細(xì)胞增殖能力比較。n=3,*P<0.05與對(duì)照組[PDGF-BB(-),噻托溴銨(-)]比較;#P<0.05與PDGF-BB處理組[PDGF-BB(+),噻托溴銨(-)]比較。圖1 噻托溴銨抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs活力和增殖

2.2 噻托溴銨抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs遷移和侵襲

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,噻托溴銨可以逆轉(zhuǎn)PDGF-BB誘導(dǎo)的傷口愈合能力的增加(圖2A—B)。Transwell分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PDGF-BB刺激極大地誘導(dǎo)了ASMCs的遷移和侵襲,而噻托溴銨以劑量依賴的方式部分抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用(圖2C—E)。

圖2 噻托溴銨抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs遷移和侵襲

2.3 噻托溴銨調(diào)節(jié)ASMCs的表型轉(zhuǎn)變

PDGF-BB刺激下ASMCs中的MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著提高(P<0.05),見圖3A—C。噻托溴銨對(duì)ASMCs收縮表型轉(zhuǎn)換的影響:在PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中,calponin和α-SMA的表達(dá)顯著減少(P<0.05)(圖3A,3D—E);VEGF水平在PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中升高(P<0.05)(圖3F)。加入噻托溴銨逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(P<0.05)(圖3)。

A—D:10 ng·mL-1PDGF處理或不同濃度(0、5、10、20、50 μmol·L-1)噻托溴銨處理ASMCs細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、calponin和α-SMA的表達(dá)和VEGF的水平比較。n=3,*P<0.05與對(duì)照組[PDGF-BB(-),噻托溴銨(-)]比較;#P<0.05與PDGF-BB處理組[PDGF-BB(+),噻托溴銨(-)]比較。圖3 噻托溴銨調(diào)節(jié)ASMCs的表型轉(zhuǎn)變

2.4 噻托溴銨調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB信號(hào)通路

Western blot分析MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活狀態(tài),結(jié)果顯示,PDGF-BB處理的細(xì)胞中p-38、p-JNK、p-ERK、p-p65、p-NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05),噻托溴銨治療部分緩解了這些蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。見圖4。

A—F:10 ng·mL-1PDGF處理或不同濃度(0、5、10、20、50 μmol·L-1)噻托溴銨處理ASMCs細(xì)胞中p-38、p-JNK、p-ERK、p-p65、p-NF-κB的表達(dá)比較。n=3,*P<0.05與對(duì)照組[PDGF-BB(-),噻托溴銨(-)]比較;#P<0.05與PDGF-BB處理組[PDGF-BB(+),噻托溴銨(-)]比較。圖4 噻托溴銨調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB信號(hào)通路

3 討論

哮喘是一種常見病、多發(fā)病,嚴(yán)重危害青少年健康。哮喘曾被認(rèn)為是一種免疫系統(tǒng)疾病,但現(xiàn)在它更被認(rèn)為是氣道壁疾病[10]。氣道重塑在哮喘的病理發(fā)展中起著主導(dǎo)作用。ASMCs的異常增殖被認(rèn)為有助于氣道重塑[11]。PDGF是一種細(xì)胞分裂素,是刺激成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和停滯細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。PDGF-BB可以誘導(dǎo)ASMCs的增殖和運(yùn)動(dòng),最終導(dǎo)致哮喘[13]。因此,研究氣道重塑和ASMCs的生長(zhǎng)對(duì)治療哮喘非常重要。本研究結(jié)果顯示噻托溴銨能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs增殖和侵襲,并可調(diào)節(jié)ASMCs的表型轉(zhuǎn)變。因此,筆者認(rèn)為噻托溴銨可以作為一種有前途的治療哮喘的藥物。然而,其精確調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

噻托溴銨是一種長(zhǎng)效毒蕈堿受體抑制劑,是治療支氣管哮喘和慢性阻塞性肺病的強(qiáng)效藥物。有研究[14]揭示了噻托溴銨可以抑制哮喘小鼠模型中Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生和氣道炎癥,從而可能降低氣道重塑和氣道對(duì)血清素的高反應(yīng)性。另一項(xiàng)研究[15]表明,噻托溴銨通過β-catenin信號(hào)抑制乙酰甲膽堿誘導(dǎo)的ASMCs細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外間質(zhì)。本研究通過CCK-8、劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn),證實(shí)噻托溴銨可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMC的活力和運(yùn)動(dòng)性。而ASMC遷移是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素,因此,本研究推測(cè)噻托溴銨對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs的活力和運(yùn)動(dòng)性的影響可能會(huì)影響哮喘的進(jìn)展。另有研究[16]發(fā)現(xiàn),噻托溴銨/奧達(dá)特羅治療可減少香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)死亡,并提高香煙煙霧提取物暴露后的BEAS-2B細(xì)胞活力。證實(shí)噻托溴銨在肺部疾病治療中起關(guān)鍵作用。

有研究[17]證實(shí),噻托溴銨水合物抑制TNF-α誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中的NF-κB的激活。同樣,本研究結(jié)果也說明噻托溴銨可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中的MAPK/NF-κB通路活性。MAPK/NF-κB信號(hào)通路在炎癥調(diào)節(jié)中有著重要的作用[18-19],如LV等[20]證實(shí)氟非尼酮通過抑制MAPK/NF-κB通路對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用。MAPK/NF-κB通路在哮喘病理中起關(guān)鍵作用:FGF2在哮喘中過表達(dá),通過FGFR/MAPK/NF-κB通路促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的氣道炎癥反應(yīng)[21];桔梗素D3通過調(diào)節(jié)哮喘小鼠MAPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)氣道重塑和炎癥起著保護(hù)作用[22];Eupatilin抑制NF-κB和MAPK通路的激活,并增加Nrf2的表達(dá),進(jìn)而抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘[23]。這些研究證實(shí),MAPK/NF-κB途徑有望成為哮喘的治療靶標(biāo)。

本研究證實(shí)噻托溴銨可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs的增殖和侵襲,并調(diào)節(jié)ASMCs的表型轉(zhuǎn)變。在機(jī)制上,噻托溴銨可以介導(dǎo)MAPK/NF-κB通路,從而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs增殖和運(yùn)動(dòng)。為噻托溴銨預(yù)防哮喘提供了新的證據(jù)。