乙肝合并結(jié)核分枝桿菌感染患者的結(jié)核耐藥基因分布情況

孟 穎, 張 倩, 支力強(qiáng)

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710038 2.陜西省西安市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710082 3.陜西省西安市紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科, 陜西 西安 710054)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染使患者管理和結(jié)核病控制工作復(fù)雜化[1]。在2015年全球發(fā)現(xiàn)的1040萬(wàn)新結(jié)核病病例中,約120萬(wàn)病例同時(shí)感染了HBV病毒,并與較高死亡率(約30%)有關(guān)[2]。近年來,國(guó)內(nèi)學(xué)者通過開展聯(lián)合TB和HBV雙向篩查提高了抗結(jié)核治療的療效,使患者的健康狀況有所改善[2]。值得注意的是,抗藥性結(jié)核病的發(fā)病率上升已成為一個(gè)主要問題。最近的建模和菌株分型數(shù)據(jù)表明,在缺乏常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)的情況下,大多數(shù)在復(fù)治時(shí)診斷的耐多藥(MDR)結(jié)核病病例具有原發(fā)(傳播)耐藥性[3]。因此,MDR-TB/HBV在醫(yī)療保健環(huán)境中存在的治療效果不佳以及傳播風(fēng)險(xiǎn)。目前,對(duì)于TB/HBV合并感染患者的結(jié)核分枝桿菌菌株多樣性、傳播動(dòng)力學(xué)和耐藥性概況的了解仍然有限。本研究檢測(cè)了河南省南陽(yáng)地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌株的多樣性,并描述了該地區(qū)TB/HBV合并感染患者對(duì)一線抗結(jié)核藥物耐藥的頻率和分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1菌株來源:研究對(duì)來自河南省南陽(yáng)地區(qū)TB/HBV共感染患者的100株結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行了回顧性實(shí)驗(yàn)室分析,其中Beijing譜系株最為普遍(49%),其次是EAI譜系株(35%),少數(shù)菌株包括Haarlem(2.0%)、LAM(1.0%)、MANU(3.0%)、T(4.0%)和U(6.0%)。所有菌株均于2014年至2018年從患者的痰、胸腔積液標(biāo)本中分離。從實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)收集人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),包括年齡、性別和居住地。

1.2藥敏試驗(yàn):原代分枝桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基上。所有被鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株均采用標(biāo)準(zhǔn)比例法[3]對(duì)異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)。培養(yǎng)物在具有以下臨界藥物濃度的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng):異煙肼(0.2μg/mL)、利福平(40μg/mL)、鏈霉素(4μg/mL)和乙胺丁醇(2μg/mL)。

1.3Spoligotyping、MIRU-24分型和基因測(cè)序:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行Spoligotyping研究,并使用國(guó)際SIVITWEB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/)和SPOTCLUST(http://cgi2.cs.rpi.edu/～bennek/SPOTCLUST.html)。根據(jù)Supply的方案(2006)對(duì)24個(gè)位點(diǎn)穿插重復(fù)單元(MIRU-24分型)進(jìn)行了研究,并使用miru-vntrplus.org在線數(shù)據(jù)庫(kù)分配使用MIRU-24分型的菌株譜系。從懸浮于200μL TE緩沖液1X(1mM EDTA,10mM Tris HCl)中的結(jié)核分枝桿菌菌落中提取DNA。將提取的DNA儲(chǔ)存在-20℃的冷凍管中用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析。如前所述進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),結(jié)核分枝桿菌H37RV為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)rpoB、katG、inhA和inhA啟動(dòng)子、rpsL、rrs和embB基因進(jìn)行了擴(kuò)增和片段分析。研究分析了6個(gè)已知與結(jié)核分枝桿菌耐藥性有關(guān)的基因片段中的9個(gè):embB基因(1個(gè)片段)、rpsL(1個(gè)片段)、rrs(2個(gè)片段)、rpoB(1個(gè)片段)、katG(2個(gè)片段)、inhA基因及其啟動(dòng)子。使用Bioedit Sequence Alignment Editor和Sequence Scanner軟件創(chuàng)建每個(gè)片段的共有序列。將片段序列與H37Rv(GenBank NC.000962.3;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)進(jìn)行比較以評(píng)估突變的存在。

2 結(jié) 果

2.1患者的一般資料和細(xì)菌學(xué)特征:TB/HBV合并感染病例中,大多數(shù)(63.2%)是年輕人(25～34歲)(表1)。痰涂片鏡檢結(jié)果占93.0%,痰涂片陽(yáng)性率為38.7%?？偟膩碚f,42(42.0%)個(gè)分離株對(duì)至少一種抗結(jié)核藥物具有體外耐藥性;9(9.0%)個(gè)分離株為MDR,5(5.0%)個(gè)分離株對(duì)所有測(cè)試的一線藥物具有泛耐藥。對(duì)異煙肼的耐藥率為25.0%(25/100),利福平的耐藥率為10.0%(10/100),乙胺丁醇的耐藥率為5.0%(5/100),和鏈霉素的耐藥率為40.0%(40/100)。

表1 患者的一般資料和細(xì)菌學(xué)特征

2.2TB/HBV合并感染患者分離的耐藥結(jié)核分枝桿菌突變:表2顯示了在耐藥結(jié)核分枝桿菌分離株中觀察到的所有突變(包括在本研究中相同突變與抗性無(wú)關(guān)的情況)。在25個(gè)異煙肼耐藥性分離株中,分別有100%和21%的katG和inhA(包括inhA啟動(dòng)子)發(fā)現(xiàn)基因突變。在異煙肼耐藥株中觀察到最常見的katG突變(463 G→T;Arg463Leu)。在inhA基因(Ser94Ala)中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變,而啟動(dòng)子inhA區(qū)在-15(14%)和-191(5%)位置具有突變。所有對(duì)利福平具有抗性的菌株都有rpoB基因突變;2個(gè)分離株具有一個(gè)以上的氨基酸取代(Ser531Leu和Thr481Ala;Ser531Leu和Arg529Gln)。60%的利福平耐藥菌株中存在最常見的突變(531 C→T;Ser531Leu)。90%(9/10)具有利福平抗性的分離株在RRDR中具有突變(密碼子507～533)。共有2株利福平耐藥菌株在RRDR外有突變,1株在密碼子572處,1株在密碼子481處。在embB基因中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)多態(tài)性(表2)。密碼子378(A→C,Glu-Ala)的突變很常見,然而,它被認(rèn)為是一種系統(tǒng)信息突變,只有1/5(20.0%)具有這種突變的菌株對(duì)乙胺丁醇具有抗性(表2)。對(duì)rpsL和rrs基因進(jìn)行測(cè)序以探索與鏈霉素抗性相關(guān)的突變。rpsL基因的突變存在于24/40(60%)鏈霉素抗性分離株中;主要是密碼子43(47.5%)和88(12.5%)。一個(gè)菌株在rpsL(Lys43Arg)和rrs基因的密碼子1401處發(fā)生突變,這與對(duì)二線治療的耐藥性相關(guān)。rrs基因突變不太常見,存在于6/40(15%)鏈霉素抗性分離株中。在沒有鏈霉素抗性的菌株中未發(fā)現(xiàn)rpsL或rrs基因突變。

表2 從TB/HBV合并感染患者分離的耐藥結(jié)核分枝桿菌突變

2.3TB/HBV合并感染患者的結(jié)核菌株多樣性和菌株相關(guān)耐藥性:表3顯示了觀察到的結(jié)核分枝桿菌菌株多樣性和菌株相關(guān)的藥物抗性。Beijing譜系株最為普遍(49%),其次是EAI譜系株(35%),少數(shù)菌株包括Haarlem、LAM、MANU、T和U。59.5%存在耐藥性的菌株屬于北京譜系,66.7%的MDR菌株屬于北京譜系。在EIA譜系菌株中,亞系EAI-5占分離株的77.1%(27/35),包括所有MDR菌株。無(wú)論是Spoligotyping還是MIRU-24都不能充分區(qū)分北京譜系菌株,但觀察到的可變耐藥譜并不表明存在大的傳播群。

表3 TB/HBV合并感染患者的結(jié)核菌株多樣性和菌株相關(guān)耐藥性

2.4MDR患者中顯性結(jié)核分枝桿菌菌株譜系與耐藥突變之間的關(guān)聯(lián):表4反映了在MDR-TB患者中觀察到的耐藥性突變,均發(fā)生在Beijing和EAI譜系菌株。無(wú)論菌株背景如何,在大多數(shù)MDR分離株中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)突變(rpoB Ser531Leu和katG Ser315Thr)。在9種MDR分離株中,7種(77.8%)在katG基因中具有Ser315Thr取代,1種(11.1%)在inhA基因啟動(dòng)子中具有-15(C-T)取代。在rpoB基因中,5個(gè)(55.6%)MDR分離株具有Ser531Leu和1個(gè)MDR分離株在RRDR區(qū)域外(在密碼子572處)具有單個(gè)突變。

表4 MDR患者中顯性結(jié)核分枝桿菌菌株譜系與耐藥突變之間的關(guān)聯(lián)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)鏈霉素耐藥性在TB/HBV合并感染患者中很常見,并且?guī)缀跗毡榇嬖谟谀退幉±小＿@一觀察結(jié)果與最近在我國(guó)西南地區(qū)的觀察結(jié)果相似,其中耐多藥結(jié)核病的傳播是由對(duì)所有一線藥物具有泛耐藥性的Beijing譜系菌株驅(qū)動(dòng)[4]。在結(jié)核病控制計(jì)劃中,鏈霉素最近(2016年)被乙胺丁醇取代,成為標(biāo)準(zhǔn)一線治療強(qiáng)化階段的第四種藥物。rpsL基因43和88密碼子突變占鏈霉素耐藥菌株的60%。rrs基因的突變主要在密碼子514和516處,在1400(1401)區(qū)只有一個(gè)突變,這與體外對(duì)所有二線注射藥物的耐藥性有關(guān)[5]。與有關(guān)TB感染患者常見的利福平單藥耐藥的報(bào)道相反[6],本研究在TB/HBV合并感染中未檢測(cè)到利福平的單藥耐藥性,這種差異可能是由HBV共感染引起的。

在異煙肼耐藥菌株中,密碼子463的突變最常見,并且與保留的野生型katG活性有關(guān)。在本研究中,大多數(shù)異煙肼耐藥菌株具有Ser315Thr取代,而在inhA基因或其啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)極少數(shù)突變,表明絕大多數(shù)異煙肼耐藥菌株在katG基因中具有突變并且與高水平的異煙肼耐藥性相關(guān)。本研究中,未觀察到乙胺丁醇對(duì)單一藥物的耐藥性。在乙胺丁醇耐藥菌株中,密碼子378(A→C,Glu-Ala)的突變很常見,然而,它已被認(rèn)為是具有系統(tǒng)信息的突變,并且只有1/5(20.0%)具有該突變的菌株對(duì)乙胺丁醇的抗性[7]。密碼子306在突變中的作用是不確定的,因?yàn)樗ǔＴ谝野范〈寄退幮院鸵赘蟹蛛x株中檢測(cè)到。embB密碼子306、406和497中的突變均與低水平的乙胺丁醇抗性相關(guān)。

Beijing系菌株占所有菌株的近一半,并且在MDR菌株中占大多數(shù)。這與非HBV感染患者的先前發(fā)現(xiàn)是一致的[8]。Beijing毒株在大多數(shù)亞洲國(guó)家非常流行,在非洲部分地區(qū)的TB/HBV患者中也占主導(dǎo)地位[1]。在EAI譜系中,亞譜系5的比例過高,而亞譜系EAI4-VNM在非HBV感染結(jié)核病患者中最為常見。這種差異可能是由HBV共感染引起的,或者表明HBV攜帶者之間可能存在傳播。此外,rpoB基因531密碼子突變和katG基因315密碼子突變與Beijing基因型及多藥耐藥有很強(qiáng)的相關(guān)性。本研究包括在本地區(qū)診斷出的有限數(shù)量的TB/HBV共感染患者,這可能并不能代表本地區(qū)所有TB/HBV共感染患者,但它為本地區(qū)TB/HBV合并感染患者的耐藥性突變和結(jié)核分枝桿菌菌株多樣性提供了數(shù)據(jù)支持。雖然對(duì)新發(fā)和復(fù)治結(jié)核病病例的結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行評(píng)估是有意義的,但實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有這些信息。

總之,TB/HBV合并感染患者的結(jié)核分枝桿菌分離株顯示出較高的耐藥率,其中以Beijing譜系為主。需要更詳細(xì)的基因組分析來探索可能影響對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥性的傳播模式和突變。