基于TM2D1介導(dǎo)鐵死亡探討丙泊酚抑制結(jié)直腸癌的分子機(jī)制

路 艷, 樸宗方, 譚新敏, 蘇 銳

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院本部麻醉科, 河北 承德 067000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)。結(jié)直腸癌的早期癥狀可能不明顯,但隨著腫瘤的進(jìn)展,出現(xiàn)便血、腹瀉、排便習(xí)慣改變、局部腹痛、貧血等癥狀,嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量[1]。為提高結(jié)直腸癌的治療效果,常采用化療、放療、手術(shù)切除聯(lián)合治療。常規(guī)治療通常伴隨著嚴(yán)重的副作用、毒性或化療耐藥[2]。因此,尋找對(duì)結(jié)直腸癌有效且具有良好毒性的新藥仍然是研究人員的首要任務(wù)。2,6-二異丙基苯酚(丙泊酚)不僅是臨床麻醉常用的靜脈麻醉劑,還被發(fā)現(xiàn)具有相當(dāng)?shù)姆锹樽硖匦?包括能夠預(yù)防惡心和嘔吐,激活γ-氨基丁酸受體以增強(qiáng)鎮(zhèn)痛,調(diào)節(jié)一氧化氮合成,并發(fā)揮抗氧化,神經(jīng)保護(hù),抗焦慮,免疫調(diào)節(jié)和抗血小板聚集作用[3]。丙泊酚還被發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA表達(dá)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡和免疫系統(tǒng)功能,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性[4]。結(jié)直腸癌手術(shù)期間異丙酚麻醉可提高生存率,另一項(xiàng)研究表明,異丙酚通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)生[5]。上述數(shù)據(jù)表明丙泊酚在抑制結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生方面具有有益作用,但其潛在的機(jī)制仍然知之甚少。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是臨床癌癥治療的主要策略,大多數(shù)抗癌藥物通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死來(lái)消除腫瘤細(xì)胞,由于癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死具有獲得性或固有的抗性,通過(guò)這些機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的有效性有限。鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性和活性氧(ROS)相關(guān)的細(xì)胞死亡類(lèi)型,其特征是ROS的積累和細(xì)胞抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的失活,從而導(dǎo)致氧化還原失調(diào)。研究報(bào)道誘導(dǎo)鐵死亡成功殺死腫瘤細(xì)胞,可抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。在結(jié)直腸癌中,鐵死亡的激活也被認(rèn)為是一種有效療法,其潛在機(jī)制已被廣泛報(bào)道,先前的研究報(bào)道,異丙酚通過(guò)ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[7]。因此,假設(shè)異丙酚可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡來(lái)抑制結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)TM2D1在肝癌中高表達(dá),并參與其的EMT過(guò)程,與腫瘤進(jìn)展相聯(lián)系[8]。TM2D1在腫瘤細(xì)胞中的具體作用和機(jī)制尚待探索。因此,本研究主要探究丙泊酚通過(guò)TM2D1介導(dǎo)鐵死亡抑制結(jié)直腸癌的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料:自2020年1月至2022年1月期間收集醫(yī)院接受結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)90對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁組織,從中選取12對(duì)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織。患者年齡18-90歲,平均年齡(73.8±4.7)歲,男女比例1∶1。所有患者均提供了書(shū)面知情同意書(shū),本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):CYFYLL2022212)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:合并自身免疫性疾病患者;其他惡性腫瘤病史;術(shù)前放療史;不能配合調(diào)查的老年患者。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在DMEM (Gibco)補(bǔ)充10%的牛胎牛油(Gibco),并保持在37℃含5%二氧化碳的空氣中,異丙酚在DMSO中稀釋,后在培養(yǎng)基中稀釋到特定濃度,SW480細(xì)胞分別用異丙酚(50μm)在室溫下處理,未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:利用GenScript合成人TM2D1 cDNA序列,并將其插入pcDNA3.1載體(Invitrogen),將SW480細(xì)胞(70-90%合流)接種于6孔板中,轉(zhuǎn)染TM2D1基因重組載體pcDNA3.1-TM2D1 (pc-TM2D1;10 nM)或pcDNA3.1空白載體(pcDNA3.1;10 nM)使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen),根據(jù)制造商的協(xié)議,轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞接受丙泊酚處理,37℃孵育5h后,將未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pc-TM2D1或pcDNA3.1的SW480細(xì)胞暴露于DMEM或添加50μm丙泊酚的培養(yǎng)基中。對(duì)照組將SW480細(xì)胞置于對(duì)照培養(yǎng)基中,不轉(zhuǎn)染。48h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT:MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,將SW480細(xì)胞以4×103細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中,孵育48h后,每孔中加入10μL MTT溶液(Beyotime Institute of Biotechnology),進(jìn)一步孵育4h。隨后丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基,向細(xì)胞中加入150μL DMSO。采用高通量通用微孔板測(cè)定法(BMG Labtech GmbH)在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.5菌落形成測(cè)定:在集落形成實(shí)驗(yàn)中,將對(duì)照組、丙泊酚組、丙泊酚+ pcDNA3.1組和異丙酚+ pc-TM2D1組的1×103SW480細(xì)胞置于3.5cm培養(yǎng)皿中,在添加10%胎牛血清的培養(yǎng)基中維持,使其形成集落,每4d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)約2周后,室溫甲醇固定菌落15min,室溫0.1%結(jié)晶紫染色15min,人工計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的染色菌落。

1.6脂質(zhì)過(guò)氧化[硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)]:脂質(zhì)過(guò)氧化用TBARS試劑盒檢測(cè)使用含有SW480細(xì)胞(1×107/mL)的RIPA裂解緩沖液(Beyotime Institute of Biotechnology),采集經(jīng)異丙酚處理和/或pc-TM2D1轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞,移入離心管,室溫下1000×g離心10min,用微孔板讀卡器在535 nM處檢測(cè)上述溶液的吸光度。

1.7測(cè)量總鐵和Fe2+水平:鐵檢測(cè)試劑盒用于測(cè)量總鐵和Fe2+細(xì)胞中的水平,總共2×106SW480細(xì)胞在4-0倍鐵測(cè)定緩沖液中快速均質(zhì),樣品在4℃下13000 × g離心10min,去除不溶性物質(zhì)。為了測(cè)量總鐵,在每個(gè)樣品孔中加入5μL鐵還原劑以將Fe3+還原為Fe2+,并用移液器將樣品充分混合,后在室溫黑暗中孵育30min。為了測(cè)量亞鐵水平,在一組孔中向樣品中加入5μL實(shí)驗(yàn)緩沖液,在另一組孔中加入5μL鐵還原劑,將100μL鐵探針添加到含有標(biāo)準(zhǔn)或測(cè)試樣品的每個(gè)孔中,樣品使用移液槍混合,后在室溫下黑暗孵育60min。最后,在593nM處測(cè)量吸光度。

1.8ROS檢測(cè):使用2',7'-雙乙酸二氯熒光素(DCFDA)-ROS試劑盒,將SW480細(xì)胞以1×105/mL的密度于6mm的培養(yǎng)皿中,并允許貼壁過(guò)夜,過(guò)表達(dá)TM2D1的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染TM2D1的細(xì)胞用對(duì)照培養(yǎng)基或異丙酚孵育48h,用Hanks平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,用DCFDA在37℃下孵育45min,倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)ROS水平。采用ImageJ軟件測(cè)量。

1.9qPCR:采用TRIzol試劑(Invitrogen),根據(jù)制造商的協(xié)議,使用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara)在42℃下將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 30min,qPCR隨后使用SYBR-Green Master PCR混合物(Applied Biosystems)的TP800熱循環(huán)器DiceTM實(shí)時(shí)系統(tǒng)(Takara Biotechnology Co)。采用以下熱循環(huán)條件:95℃初始變性10min,95℃變性15s,60℃變性1min,40個(gè)循環(huán),最后延長(zhǎng)至72℃延長(zhǎng)10min,使用2-ΔΔCq方法量化TM2D1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(20),并歸一化為GAPDH(內(nèi)參)。

1.10蛋白質(zhì)印跡:使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Sigma Chemical Co.)的RIPA裂解緩沖液(Beyotime Biotech)中提取組織蛋白。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,使用8%SDS-PAGE分離相同量的蛋白質(zhì)(20μg)并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(Bio-Rad),在室溫下用5% BSA在Tris緩沖鹽水(TBS)中用5% BSA封閉印跡1h,待測(cè)蛋白與抗體4℃靜置過(guò)夜,后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG檢測(cè)結(jié)合抗體,并用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(賽默飛)可視化,使用Image J軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。

2 結(jié) 果

2.1TM2D1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá):結(jié)果顯示了與癌旁組織相比,TM2D1表達(dá)水平在CRC組織中顯著上調(diào),表明TM2D1在結(jié)直腸癌中的潛在作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 TM2D1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

2.2丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、集落形成能力及細(xì)胞增殖蛋白的作用:與對(duì)照組比較,丙泊酚處理顯著抑制細(xì)胞增殖,對(duì)細(xì)胞集落形成起抑制作用。同樣,丙泊酚處理下調(diào)了參與細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)(包括Ki67和PCNA)的表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2,圖1。

圖1 丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌的作用

表2 丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌的作用

2.3丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞TM2D1表達(dá)的影響:為了確定TM2D1在CRC中的作用,分析了TM2D1在細(xì)胞中的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比,丙泊酚降低了TM2D1表達(dá)水平,與丙泊酚組比較,過(guò)表達(dá)TM2D1組,TM2D1在SW480細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2,表3。

圖2 丙泊酚對(duì)TM2D1表達(dá)的影響

表3 丙泊酚對(duì)TM2D1表達(dá)的影響

2.4TM2D1對(duì)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響:研究結(jié)果顯示,丙泊酚刺激后CRC細(xì)胞中的鐵死亡水平。與對(duì)照組比較,丙泊酚治療TBAR、總細(xì)胞鐵,Fe2+和ROS顯著增加,此外,丙泊酚處理上調(diào)CHAC1和PTGS2的蛋白表達(dá)水平,而GPX4的蛋白表達(dá)水平下調(diào),然而,與丙泊酚組比較,過(guò)表達(dá)TM2D1組與之相反,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4,圖3。

圖3 TM2D1對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響

表4 TM2D1對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和鐵死亡的影響

3 討 論

結(jié)直腸癌的高發(fā)病率和高死亡率的原因仍未確定。手術(shù)切除腫瘤是目前臨床治療結(jié)直腸癌的主要方法,手術(shù)可以促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移,因?yàn)槭中g(shù)允許癌細(xì)胞逃逸并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),這是有效治療CRC的一個(gè)迫切需要解決的重大挑戰(zhàn),有報(bào)道稱(chēng),麻醉劑可以改善手術(shù)后患者的長(zhǎng)期預(yù)后,特別是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,丙泊酚可以抑制不同類(lèi)型癌癥的細(xì)胞增殖,包括CRC[10]。丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展的影響的具體分子機(jī)制仍有待確定。本研究結(jié)果表明,丙泊酚治療可顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞鐵死亡,抑制CRC細(xì)胞增殖,提示丙泊酚可能在CRC中發(fā)揮抑瘤作用。

研究顯示鐵死亡誘導(dǎo)劑(如erastin、sorafenib和sulfasalazine)已顯示出有益的抗腫瘤作用,已有相關(guān)抗癌藥物已被確定為鐵死亡誘導(dǎo)劑,例如,索拉非尼被發(fā)現(xiàn)可以增加肝細(xì)胞癌中的脂質(zhì)氧化水平,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。在胰腺癌中,熱休克蛋白A5(HSPA5)/GPX4信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)了對(duì)吉西他濱的耐藥,而HSPA5或GPX4的敲低逆轉(zhuǎn)了這種耐藥,研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,因?yàn)橐阎狦PX4可以減少脂質(zhì)自由基的積累,防止鐵死亡的發(fā)生和發(fā)展[12]。研究報(bào)道青蒿素及其衍生物在KRAS基因突變的胰腺癌細(xì)胞中引發(fā)鐵凋亡,但對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用很小,原花青素治療顯著抑制脊髓損傷患者鐵、TBAR、?；o酶a合成酶4和花生四烯酸15-脂加氧酶B的水平,上調(diào)GSH、GPX4、核因子-紅細(xì)胞2相關(guān)因子2和血紅素加氧酶1的水平[13]。本研究首次發(fā)現(xiàn)異丙酚可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的鐵死亡。鐵積累和脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的鐵下沉被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞死亡有關(guān),目前的研究結(jié)果顯示,異丙酚治療后TBAR水平以及細(xì)胞總鐵和Fe2+水平均顯著升高,ROS的積累是鐵死亡的一個(gè)特征[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在丙泊酚刺激下,CRC細(xì)胞中的ROS水平顯著升高,表明丙泊酚可能誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡。鐵死亡受到GPX4和某些鐵轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)蛋白的嚴(yán)格控制,先前的一項(xiàng)研究報(bào)道,GPX4失活促進(jìn)CRC鐵下沉過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化積累,活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)分支是主要的信號(hào)通路,CHAC1位于ATF4的下游,已被證明可促進(jìn)GSH降解并隨后誘導(dǎo)鐵死亡。PTGS2在發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞中也會(huì)被誘導(dǎo),但PTGS2在鐵致細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)中的確切作用仍有待闡明。先前的研究報(bào)道,抑制鐵死亡誘導(dǎo)的PTGS2是緩解細(xì)胞死亡的有效方法。本研究分析了GPX4、CHAC1和PTGS2在丙泊酚治療后CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平,丙泊酚處理顯著下調(diào)GPX4表達(dá)水平,上調(diào)CHAC1和PTGS2表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表明,與其他鐵死亡誘導(dǎo)劑一致,丙泊酚可能能夠提高細(xì)胞鐵水平和ROS積累,上調(diào)CHAC1和PTGS2的表達(dá)水平,下調(diào)GPX4的表達(dá)水平。

為了進(jìn)一步確定丙泊酚影響的潛在機(jī)制,通過(guò)確定丙泊酚對(duì)TM2D1的調(diào)節(jié)。與鄰近的正常對(duì)照組織相比,TM2D1在CRC組織中表達(dá)上調(diào)。TM2D1包含與G蛋白偶聯(lián)受體超家族相關(guān)的結(jié)構(gòu)模塊,該結(jié)構(gòu)模塊具有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,可結(jié)合β-淀粉樣蛋白,TM2D1以Aβ引發(fā)的半胱天冬酶依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡。最近,研究表明TM2D1也與各種癌癥患者的臨床結(jié)果有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)TM9D2在內(nèi)的1個(gè)基因,以計(jì)算宮頸鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,發(fā)現(xiàn)其可以識(shí)別具有不同死亡風(fēng)險(xiǎn)的患者。此外,先前的研究表明,丙泊酚通過(guò)調(diào)節(jié)CRC中STAT3/HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA軸抑制細(xì)胞侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,丙泊酚治療以濃度依賴(lài)的方式負(fù)向調(diào)節(jié)TM2D1的表達(dá)。TM2D1可調(diào)節(jié)鐵死亡,抑制TM2D1可以增加細(xì)胞ROS水平,降低谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫比,TM2D1過(guò)表達(dá)也促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究通過(guò)在CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TM2D1來(lái)研究丙泊酚對(duì)CRC細(xì)胞增殖和鐵凋亡的影響是否可以逆轉(zhuǎn),丙泊酚對(duì)CRC細(xì)胞增殖和集落形成的抑制作用以及丙泊酚對(duì)鐵死亡的刺激作用都被TM2D1過(guò)表達(dá)顯著抑制。結(jié)果表明丙泊酚可能通過(guò)下調(diào)TM2D1的表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述,本結(jié)果顯示丙泊酚促進(jìn)CRC細(xì)胞鐵死亡,其潛在機(jī)制可能依賴(lài)于靶向TM2D1的表達(dá)。因此,丙泊酚誘導(dǎo)的鐵死亡可能是CRC的一種有效治療方向,也為CRC的治療提供了新的思路。