基于16S rDNA測(cè)序探析早發(fā)性卵巢功能不全腎虛肝郁證患者腸道菌群的特征

黃旭春，陸巖，曹曉靜，宋雷，成芳平，王小云

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是女性在40 歲之前出現(xiàn)卵巢功能衰退的臨床綜合征，以停經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)、伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。POI 有發(fā)病率逐年升高并向低齡化發(fā)展的態(tài)勢(shì)，多伴生育能力低下甚至不孕，并可增加骨質(zhì)疏松和心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，可導(dǎo)致患者產(chǎn)生負(fù)面心理等，嚴(yán)重影響其身心健康[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用激素替代療法治療POI。有研究表明，腸道菌群失衡與衰老關(guān)系密切。腸道菌群與線粒體之間存在對(duì)話，而線粒體可引起顆粒細(xì)胞凋亡、自嗜，使卵泡閉鎖，導(dǎo)致卵巢功能提前衰退[2]。目前對(duì)腸道菌群與POI 相關(guān)性的研究尚處于初探階段，小樣本量研究顯示，POI 的發(fā)生可能與腸道菌群紊亂有關(guān)[3]。中藥可通過抑制氧化損傷改善卵泡和顆粒細(xì)胞的功能狀態(tài)[4]。本研究通過16S rDNA高通量測(cè)序探析腎虛肝郁型POI 患者的腸道菌群特征，為中醫(yī)藥辨證治療POI 提供循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2020 年1 月—2021 年12 月就診于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院的60 例POI 患者，設(shè)為POI 組，同時(shí)招募健康志愿者30 例，設(shè)為健康對(duì)照組。本研究方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)BF2019-118-01）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《早發(fā)性卵巢功能不全中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[1]制定。年齡＜40 歲；出現(xiàn)月經(jīng)周期延長(zhǎng)、周期不規(guī)律，經(jīng)量減少、月經(jīng)稀發(fā)，閉經(jīng)至少4 個(gè)月；至少2 次血清促卵泡生成素（FSH）＞25 U/L（在月經(jīng)周期的第2～4 天，或閉經(jīng)時(shí)檢測(cè)，2 次檢測(cè)間隔4 周）；血清抗苗勒激素（AMH）≤7.85 pmol/L（即1.1 ng/mL）；亞臨床期POI：FSH 水平在15～25 U/L。

1.3 辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《婦科常見病中醫(yī)診療指南》[5]辨為腎虛肝郁證。主癥：月經(jīng)周期延后，腰膝酸軟，煩躁易怒；次癥：月經(jīng)量少、色暗、夾血塊或閉經(jīng)，烘熱汗出，精神抑郁，胸悶嘆息；舌脈象：舌質(zhì)偏暗、苔薄黃或薄白，脈弦細(xì)、尺脈無力。主癥必備，含次癥2 項(xiàng)以上，參照舌脈象即可確診。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)①POI 組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡20～40 歲；閉經(jīng)時(shí)間＜6 個(gè)月；FSH＜40 U/L；18＜體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＜24；簽署知情同意書。②健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～40 歲；月經(jīng)規(guī)律者；基礎(chǔ)性激素在正常范圍；18＜BMI＜24；身體健康，無內(nèi)、外科重大疾病；簽署知情同意書。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)合并其他內(nèi)分泌失調(diào)疾病，如高泌乳素血癥、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等；妊娠期或哺乳期婦女；參與研究前3 個(gè)月內(nèi)使用過激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑、大豆提取物或中藥等治療；有習(xí)慣性使用抗生素史或參與研究前1 個(gè)月內(nèi)有使用抗生素、益生菌、益生元、微生態(tài)活菌制劑；參與研究前1 個(gè)月內(nèi)使用瀉藥或其他影響胃腸功能的藥物；嚴(yán)重肝、腎、心、腦疾病患者；惡性腫瘤患者；重度精神障礙性疾病患者。

2 研究方法

2.1 標(biāo)本采集時(shí)間與方法①性激素[FSH、促黃體生成素（LH）、雌激素（E2）]。抽血時(shí)間：月經(jīng)來潮第2～4 天（卵泡早期）；若無月經(jīng)來潮，婦科B 超檢查顯示子宮內(nèi)膜（EN）厚度＜6 mm，則提示卵泡早期；若EN 厚度≥6 mm，則建議等待月經(jīng)來潮或黃體酮撤退性出血后第2～4 天抽血。②腸道菌群。收集糞便時(shí)間同性激素檢查抽血時(shí)間。留取患者自然排出的當(dāng)日初次新鮮糞便標(biāo)本，取3 g 左右樣本分裝于收集管中，在留取標(biāo)本20 min 內(nèi)將其放置于-80 ℃冰箱進(jìn)行超低溫凍存。委托深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行后續(xù)DNA 提取，采用16S rDNA 高通量測(cè)序分析工作。

2.2 樣本DNA 提取和16S rDNA 測(cè)序使用MagPure 糞便DNA KF 試劑盒B（Magen，中國(guó)）提取微生物群落DNA。使用Qubit dsDNA BR 檢測(cè)試劑盒（Invitrogen，美國(guó)），用量子比特?zé)晒庥?jì)對(duì)DNA 進(jìn)行定量，并在1%瓊脂糖凝膠上定量檢測(cè)其質(zhì)量。采用簡(jiǎn)易實(shí)時(shí)熒光定量（PCR）引物515F515F（5'-GTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的文庫配置可變區(qū)V4。正向和反向引物均用Illumina 適配器、pad 和連接子序列進(jìn)行標(biāo)記。PCR 體系構(gòu)建：取30 ng DNA 樣品及引物（V3V4 區(qū)引物 338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHV GGGTWTCTAAT）配置PCR 反應(yīng)體系。設(shè)置PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：98 ℃（1 min），98 ℃（10 s），50 ℃（30 s）—30 cycles；72 ℃（60 s），72 ℃（10 min）。PCR 產(chǎn)物用Agcurt AMPure XP 純化，洗脫緩沖液洗脫。文庫經(jīng)過了安捷倫科技2100 生物分析儀的鑒定。驗(yàn)證后的文庫在伊利HiSeq 2500 平臺(tái)（BGI，深圳）上按照標(biāo)準(zhǔn)管道進(jìn)行測(cè)序，生成2×250 bp 的對(duì)端reads。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]描述；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示。計(jì)量資料若服從正態(tài)性，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；若非正態(tài)性，組間比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。檢驗(yàn)水平α=0.05。利用Mothur 軟件（version：1.31.2）進(jìn)行Alpha 多樣性分析（Chao1 物種豐富度統(tǒng)計(jì)，Shannon，Simpson 等物種多樣性統(tǒng)計(jì)）和使用QIIME中的beta_diversity.py 工具計(jì)算Beta 多樣性指數(shù)，采用R（v3.1.1）的VennDiagram 包進(jìn)行韋恩圖分析，采用R（v3.4.1）進(jìn)行物種組成分析。

3 研究結(jié)果

3.1 一般資料見表1。POI 組與健康對(duì)照組在年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、婚姻、E2水平方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在初潮年齡、孕次、產(chǎn)次及FSH、LH、AMH 水平方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 POI 組與健康對(duì)照組一般資料比較[M（P25，P75）或（）或例（%）]

表1 POI 組與健康對(duì)照組一般資料比較[M（P25，P75）或（）或例（%）]

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3.2 腸道菌群

3.2.1 樣本數(shù)量見圖1。共納入合格糞便樣本90 份，其中健康對(duì)照組30 份，POI 組60 份。隨著樣本量的增加，物種豐度曲線曲度無顯著變化，曲線趨于平緩，表明本試驗(yàn)樣本數(shù)量已滿足檢出大部分物種的條件，抽樣充分，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖1 物種累積曲線圖

3.2.2 組成分析見圖2。分別繪制門和屬分類水平的群落柱形圖，以獲得組間不同樣本腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)。在門水平上主要有古菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門等，其中擬桿菌門、厚壁菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌。此外，2 組樣本在門水平組成上也有差異，相對(duì)于健康對(duì)照組，POI 組擬桿菌門等相對(duì)豐度升高，厚壁菌門、放線菌門等相對(duì)豐度降低。在屬水平上主要有梭狀芽胞桿菌屬XIVa、副薩特氏屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、巨型單胞菌屬、擬桿菌屬、普雷沃菌屬、芽孢桿菌屬、毛螺旋菌屬等，其中糞桿菌屬、擬桿菌屬、普雷沃菌屬、梭狀芽胞桿菌屬XIVa、巨型單胞菌屬是主要優(yōu)勢(shì)菌。相對(duì)于健康對(duì)照組，POI 組普雷沃菌屬、擬桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬XIVa 等相對(duì)豐度升高，糞桿菌屬等相對(duì)豐度降低。

圖2 物種組成柱形圖

3.2.3 物種韋恩圖分析見圖3。POI 組OTU 數(shù)為945，健康對(duì)照組OTU 數(shù)為778，兩者取交集共有的OTU 數(shù)為717（在POI 組中占比75.87%，在健康對(duì)照組中占比92.16%）。說明2 組大部分腸道菌群種類相似。結(jié)合圖2，可以確定種類相似者構(gòu)成比例的上調(diào)與下調(diào)也有一定差別，或可將此作為POI 組區(qū)別于健康對(duì)照組的特征性菌群，為進(jìn)一步尋找和發(fā)現(xiàn)菌群標(biāo)志物提供依據(jù)。

圖3 OTU 韋恩圖

3.2.4 Alpha 多樣性分析見圖4。POI 組OTU 數(shù)目的中位值、ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)的中位值、Shannon 指數(shù)的中位值均低于健康對(duì)照組，即在群落豐富度上POI 組差于健康對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。POI 組Coverage 指數(shù)和Sinmpson 指數(shù)均高于健康對(duì)照組，即其物種覆蓋度和多樣性多于健康對(duì)照組，其中物種覆蓋度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在物種多樣性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 Alpha 多樣性箱線圖

3.2.5 Beta 多樣性分析見圖5。如圖5（a）所示，每一個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)代表一個(gè)樣本，藍(lán)色圓點(diǎn)代表POI患者，橘色三角形代表健康人，兩個(gè)點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)表示兩者的群落構(gòu)成差異越大。通過比對(duì)POI 組與健康對(duì)照組的主坐標(biāo)分析（PCoA）可以發(fā)現(xiàn)，2 組樣本之間部分空間距離相對(duì)集中，說明組內(nèi)部分個(gè)體間差異偏小，且組間樣本有部分重疊，但仍可以看出2 組之間存在一定的離散趨勢(shì)。圖5（b）提示，POI組與健康對(duì)照組腸道菌群構(gòu)成有一定的差異，與前文的Alpha 多樣性和物種韋恩圖分析結(jié)果一致。

圖5 PCoA 及偏最小二乘回歸分析法（PLS-DA）圖

3.2.6 物種差異分析見圖6。圖6（a）不同顏色節(jié)點(diǎn)表示對(duì)應(yīng)組別中顯著富集，且與另一組間差異存在顯著影響的微生物類群。圖6（b）的LEfSe 柱狀圖統(tǒng)計(jì)了2 組有顯著作用的微生物類群通過線性判別分析（LDA）后獲得的LDA 分值，LDA 分值越大，代表物種豐度對(duì)差異效果影響越大，綠色代表POI 組富集的物種，紅色代表健康對(duì)照組富集的物種。從2 組的LEfSe 柱形圖可以看出，分類單元在健康對(duì)照組豐度較高的顯著性差異物種從門到屬水平分別是：厚壁菌門、放線菌門、放線菌綱、大腸桿菌目、大腸桿菌科、毛螺菌科、放線菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、毛螺菌屬、梭菌屬、布勞特氏菌屬、普雷沃氏菌屬、擬普雷沃氏菌屬、脫硫弧菌屬、柯林斯氏菌屬、丁酸球菌屬、多爾氏菌屬。分類單元在POI組豐度較高的腸道菌群顯著性差異物種從門到屬水平分別是：古菌門、甲烷桿菌目、莫拉菌科、甲烷桿菌科、類芽孢桿菌科、不動(dòng)桿菌屬、古菌屬、短桿菌屬、甲烷桿菌屬。

圖6 POI 組與健康對(duì)照組物種差異分析

4 討論

腸道菌群是人體胃腸道內(nèi)的一群規(guī)模宏大、種類紛繁復(fù)雜的微生物群落。腸道菌群寄生在胃腸道表面，大多數(shù)不具有致病性，可以與腸上皮細(xì)胞共生。基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展闡釋了其對(duì)健康的影響，以及微生物與宿主的相互作用關(guān)系。正常的腸道微生物群在宿主營(yíng)養(yǎng)代謝、外源物質(zhì)和藥物代謝、維持腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性、免疫調(diào)節(jié)和抵抗病原體方面具有特定的功能。人類腸道菌群主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門4 個(gè)門類，其中擬桿菌門和厚壁菌門是最主要的門。擬桿菌門和厚壁菌門的豐度與脂肪沉積密切相關(guān)，厚壁菌門具有促進(jìn)碳水化合物和蛋白質(zhì)消化、吸收以保障人體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的功能，擬桿菌門具有促進(jìn)多糖分解以提高機(jī)體免疫的功能。在能量的轉(zhuǎn)化和存儲(chǔ)過程中，擬桿菌門和厚壁菌門可以協(xié)同作用，共同促進(jìn)卵巢和子宮發(fā)育[6]。

一項(xiàng)關(guān)于POI 與腸道菌群的研究結(jié)果提示，相比于健康人群，POI 患者擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低[7]。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，在門水平上POI 組擬桿菌門等相對(duì)豐度升高，厚壁菌門、放線菌門等相對(duì)豐度降低。說明腸道菌群的比例失調(diào)可能引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，誘導(dǎo)疾病發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在屬水平上POI 組普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬XIVa 等相對(duì)豐度升高，糞桿菌屬等相對(duì)豐度降低。隸屬于擬桿菌門的普雷沃氏菌屬具有促進(jìn)蛋白質(zhì)與碳水化合物分解的作用，通常與慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬豐度的升高與輔助性T 細(xì)胞17（Th17）介導(dǎo)的黏膜炎癥有正相關(guān)性[8]。另有研究表明，P13K/Akt 信號(hào)通路通過改變經(jīng)心內(nèi)膜人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）移植后卵巢早衰（POF）小鼠Th17/Tc17 和Th17/Treg 細(xì)胞的比例，參與了卵巢功能的修復(fù)[9]。隸屬于擬桿菌門的擬桿菌屬具有促進(jìn)多糖和蛋白質(zhì)水解的作用。擬桿菌屬包含多種可能促進(jìn)炎癥及代謝性疾病相關(guān)的條件致病菌[10]。厚壁菌門的梭狀芽胞桿菌屬多為腐物寄生菌，少數(shù)為致病菌，能分泌外毒素和侵襲性酶類，誘發(fā)疾病。有研究表明，梭狀芽孢桿菌屬與結(jié)直腸癌的發(fā)病、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[11]。糞桿菌屬可在人體腸道中產(chǎn)生乙酸、丁酸、琥珀酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）等[3，12]。SCFAs不僅具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，還可以影響心理功能和認(rèn)知過程[11]。本研究結(jié)果提示，相較于健康人群，POI 患者體內(nèi)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的相關(guān)菌群豐度上調(diào)，具有抗炎作用的有益菌菌群豐度下調(diào)，提示腸道菌群失調(diào)引起的炎癥反應(yīng)和免疫功能失衡可能是POI 的發(fā)病機(jī)制之一。

有研究發(fā)現(xiàn)，特定中醫(yī)證型狀態(tài)下的POI 患者腸道菌群相較于健康對(duì)照組可發(fā)生顯著改變，紊亂的腸道菌群伴隨著患者代謝狀態(tài)改變[13]。提示腸道菌群紊亂可以反映特定中醫(yī)證型的整體代謝改變。本研究?jī)H對(duì)POI 腎虛肝郁證患者進(jìn)行腸道菌群特征的探討，后續(xù)將開展多種證型POI 之間的臨床研究，結(jié)合宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步探究POI菌群變化的機(jī)制，為中醫(yī)藥治療POI 可能的作用機(jī)制提供高級(jí)別循證依據(jù)。