酸筍中微生物區(qū)系演替和風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制的研究進(jìn)展

薛冰潔,胡榮,吳良如,楊金來(lái),李彬,張甫生*,鄭炯*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(國(guó)家林業(yè)和草原局竹子研究開(kāi)發(fā)中心,浙江 杭州,310012) 3(重慶市林業(yè)科學(xué)院,重慶,400036)

竹筍營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)脆嫩、滋味鮮美,是一種深受廣大消費(fèi)者青睞的森林食品。我國(guó)竹筍產(chǎn)量巨大,其中60%用于加工。酸筍是以竹筍為原材料,經(jīng)無(wú)鹽或加鹽處理,在密封條件下經(jīng)微生物代謝而成的一種竹筍加工制品。酸筍按照加工技術(shù)分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵,人工發(fā)酵因具有發(fā)酵周期可控性強(qiáng)、發(fā)酵效率高、安全等優(yōu)點(diǎn)成為目前最常用的發(fā)酵方式。經(jīng)發(fā)酵處理的酸筍不僅風(fēng)味多樣,而且口感爽、脆、酸、嫩,微生物資源也更為豐富,產(chǎn)品品質(zhì)得到顯著提高,感官體驗(yàn)也更優(yōu)[1-2]。

酸筍中含有豐富的乳酸菌資源,包括明串珠菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬等。微生物的代謝是決定酸筍風(fēng)味的關(guān)鍵,乳桿菌屬、乳球菌屬與部分有機(jī)酸、低閾值的醛類、酚類以及高閾值的醇類、酯類呈顯著正相關(guān),而酸筍的復(fù)雜菌群是風(fēng)味產(chǎn)生的基礎(chǔ)條件,兩者緊密相連。目前酸筍中微生物演替以及風(fēng)味物質(zhì)形成的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。因此,本文總結(jié)了酸筍中微生物群落的構(gòu)成、變化規(guī)律及其影響因素,分類概述了酸筍中的風(fēng)味物質(zhì),從微生物代謝的角度闡釋了酸筍中風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理,旨在為酸筍品質(zhì)的提升提供理論參考。

1 酸筍發(fā)酵過(guò)程中的主要微生物群落

1.1 酸筍中微生物群落的構(gòu)成

酸筍中的微生物以細(xì)菌為主,主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)等乳酸菌,這些通常也是發(fā)酵蔬菜中富集的優(yōu)勢(shì)菌群。研究表明,傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍中微生物群落的多樣性較高,主要為乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬等[3],其中部分菌種具有嗜鹽、嗜酸的特性。LI等[4]將廣西柳州的麻竹筍自然發(fā)酵60 d,發(fā)現(xiàn)其微生物的多樣性顯著增加。在門(mén)水平上,以藍(lán)菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為代表,在屬水平上,代表性菌屬包括假單胞菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬,明串珠菌屬。在種水平上,主要有植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、醋酸桿菌、瑞士乳桿菌等,而醋酸桿菌、乳酸桿菌是整個(gè)發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌種。為了解酸筍腌制過(guò)程中細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化,XIA等[5]在自然發(fā)酵的麻竹筍中檢測(cè)到多株嗜鹽菌,紅桿菌屬、堿桿菌屬、鹽單胞菌屬、食甲基菌屬在10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液中正常生長(zhǎng),其中格氏乳球菌、乳酸乳球菌、食竇魏斯氏菌、融合魏斯氏菌在6.5%的NaCl溶液中也可維持正?；钚?。

酸筍中相關(guān)的功能性菌株為短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、戊糖片球菌和腸系膜明串珠菌亞種等,具有益生、保健、提高食品安全性等作用[6]。研究表明,植物乳桿菌LZ-2-12的膽固醇降解率高達(dá)54.27%[7],當(dāng)植物乳桿菌LC-3-3添加量為6%,pH值為6.0、溫度為37 ℃的條件下,亞硝酸鹽的降解率為76.58%[8]。部分乳桿菌不僅具有良好的抗氧化[9]、抗炎特性[10],而且還能高效分解木聚糖[11]、高產(chǎn)乳酸和甘露糖[12-13]。

迄今為止,已明確酸筍中的真菌主要為酵母菌,但相關(guān)研究鮮少報(bào)道。GUAN等[14]首次利用高通量測(cè)序研究酸筍中的真菌群落,發(fā)現(xiàn)子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)是酸筍中的主要真菌門(mén),其中畢赤酵母屬、假絲酵母屬、德巴利酵母屬、絲孢酵母屬、青霉屬、哈薩克斯坦屬、曲霉屬為廣東酸筍的主要真菌屬,其中赤壁酵母屬最為豐富,占比28.32%,其次是含量為13.88%的假絲酵母屬,而云南酸筍中主要有赤壁酵母屬、接合酵母屬、絲孢酵母屬、哈薩克斯坦酵母屬、青霉屬,其中赤壁酵母屬為40.62%,其次為19.9%的接合酵母屬。

1.2 酸筍發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的演替

酸筍中的發(fā)酵微生物在初期變化較大,中后期趨于穩(wěn)定。腸膜明串珠菌、檸檬明串珠菌等異型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵前期占據(jù)優(yōu)勢(shì),乳酸、乙酸等有機(jī)酸不斷積累,異型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵后期被植物乳桿菌、乳酸乳球菌等同型發(fā)酵乳酸菌代替,最終乳酸菌群落趨于簡(jiǎn)單化。CHI等[15]發(fā)現(xiàn)酸筍發(fā)酵初期有酵母菌、丁酸細(xì)菌、E-大腸桿菌、霉菌等,在發(fā)酵10 d后,發(fā)酵液中的乳酸菌出現(xiàn)明顯下降,非乳酸菌群體的消失可能是由于乳球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬產(chǎn)生的抗微生物肽。GUAN等[16]利用MiSeq測(cè)序得出厚壁菌門(mén)在酸筍發(fā)酵初期持續(xù)增長(zhǎng),相對(duì)豐度最高為98.97%,其中乳桿菌屬持續(xù)為優(yōu)勢(shì)菌種,而乳球菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬和魏斯氏菌屬的豐度在發(fā)酵后期普遍降低。也有研究基于PCR-DGGE和Illumina測(cè)序技術(shù)檢測(cè)酸筍中群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明1～2 d酸筍中的乳酸菌從105 CFU/g升至109 CFU/g,以魏斯氏菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。發(fā)酵完成時(shí),僅有耐酸乳桿菌和約氏乳桿菌大量存在[17]。

1.3 酸筍中微生物群落的影響因素

發(fā)酵方式是影響酸筍微生物群落的重要因素。鄭文迪[18]從自然發(fā)酵酸筍中挑選耐酸、耐鹽,高產(chǎn)乳酸,有效降解亞硝酸的發(fā)酵乳桿菌NCU003039為發(fā)酵劑進(jìn)行人工發(fā)酵。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn),人工發(fā)酵酸筍中微生物的多樣性較低,但其安全性更高、品質(zhì)更優(yōu)。發(fā)酵劑的接種情況也會(huì)對(duì)酸筍微生物群落產(chǎn)生影響,LU等[19]將傳統(tǒng)酸筍中分離的檸檬明串珠菌NM-12和植物乳桿菌L01以不同比例接種到竹筍中,發(fā)現(xiàn)混合菌種不僅使酸類、醇類物質(zhì)含量顯著提高,而且還能抑制腸球菌和梭菌,并且植物乳桿菌的含量隨發(fā)酵劑的增加而升高。

食鹽是酸筍咸味的主要來(lái)源,同時(shí)也是影響其微生物代謝的重要因素之一[20]。研究表明,在高鹽濃度下魏斯氏菌和乳酸桿菌的活性較高,但在低鹽濃度下明串珠菌的活性較高[21],并且在2.5%和3.5%鹽濃度下含有較高數(shù)量的酵母菌[22]。也有研究得出食竇魏斯氏菌、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、乳酸乳球菌為低鹽腌制筍的主要發(fā)酵菌,而高鹽腌制筍中主要為趨向于耐鹽、耐酸性的綠色氣球菌、芽孢桿菌屬[23]。

2 酸筍中的風(fēng)味物質(zhì)

2.1 有機(jī)酸

酸筍中的有機(jī)酸來(lái)源于原料和微生物的發(fā)酵作用。在發(fā)酵前期,通過(guò)丙酮酸的還原反應(yīng)生成大量的乳酸、乙酸[24],發(fā)酵后期,各類有機(jī)酸發(fā)揮協(xié)同作用構(gòu)成酸筍的酸味。BADWAIK等[25]在鮮筍中檢測(cè)到草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸和乳酸,而發(fā)酵酸筍中檢測(cè)不到草酸和丙酮酸,但乳酸、酒石酸從初期2.824 mg/g、1.733 mg/g最高增至39.492 mg/g、51.021 mg/g。酸筍中的有機(jī)酸受到發(fā)酵方式的影響。ZHENG等[26]采用頂空固相微萃取法檢測(cè)到自然發(fā)酵酸筍中的有機(jī)酸占風(fēng)味物質(zhì)總量的11.5%,其中乙酸已占6.08%,又利用氣相色譜-嗅聞聯(lián)用技術(shù)鑒定出丁酸和己酸為主要的有機(jī)酸。LU等[19]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌與乳酸呈高度正相關(guān),而檸檬明串珠菌與乙酸呈高度的正相關(guān)。

2.2 呈味氨基酸

呈味氨基酸主要源自酸筍發(fā)酵微生物對(duì)原料中蛋白質(zhì)、肽的代謝作用,大部分氨基酸呈酸味、甜味和鮮味,小部分氨基酸呈苦味。發(fā)酵前期,竹筍的內(nèi)源酶與微生物共同作用產(chǎn)生游離氨基酸[27]。發(fā)酵后期,氨基酸作為微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)而被消耗。武源等[28]采用在酸筍中測(cè)定到16種游離氨基酸,其中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸含量較高。ZHENG等[29]發(fā)現(xiàn)酸筍中17種氨基酸的滋味活性值均小于1,但它們可轉(zhuǎn)化為酚類、醛類從而影響酸筍的滋味。WANG等[6]發(fā)現(xiàn)酸筍經(jīng)發(fā)酵后,呈味氨基酸含量顯著增加,谷氨酸為含量最高的游離氨基酸,但未檢測(cè)到半胱氨酸和精氨酸。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

酸筍中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括酚類、醛類、醇類、酯類以及其他的酮類、呋喃類等,是賦予酸筍獨(dú)特風(fēng)味的主要途徑。目前從酸筍中已鑒定出的主要風(fēng)味物質(zhì)如表1所示,酸筍中的酚類、醛類含量較高且普遍閾值較低,主要在發(fā)酵前期積累,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),是酸筍異味的主要來(lái)源,其中酚類主要源自酪氨酸的轉(zhuǎn)氨、脫羧作用,醛類來(lái)自streker降解、酵母菌的發(fā)酵作用以及支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨、脫羧作用。醇類、酯類則普遍閾值較高,主要在發(fā)酵中后期積累,賦予酸筍花果香及清香味,其中醇類源自原料和乳酸菌的發(fā)酵作用,呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢(shì),而酯類由酯化反應(yīng)和醇解作用產(chǎn)生,在發(fā)酵過(guò)程中含量不斷降低?？偟膩?lái)說(shuō),大部分風(fēng)味物質(zhì)與乳酸菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬等呈正相關(guān),與不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬等呈負(fù)相關(guān)。

表1 酸筍中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 The main volatile flavor compounds in Suansun

此外,發(fā)酵方式、發(fā)酵劑的種類和比例也會(huì)影響酸筍中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),并且采用不同測(cè)定方法,風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果也不同。研究發(fā)現(xiàn)人工發(fā)酵酸筍中的酯類含量高于自然發(fā)酵,其中乙酸甲酯的含量最高,而醛類含量低于自然發(fā)酵,酚類、酮類、酸類則較為接近[30]。郭榮燦等[31]比較研究了廣西發(fā)酵酸筍風(fēng)味物質(zhì)的不同提取方法,發(fā)現(xiàn)液液萃取法和蒸餾萃取法的萃取物質(zhì)種類分別為34種和24種,而頂空固相微萃取法的萃取物質(zhì)種類為41種。

3 微生物誘導(dǎo)酸筍風(fēng)味形成機(jī)制

微生物體系的代謝是產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的主要途徑,通過(guò)基因測(cè)序的結(jié)果構(gòu)建出酸筍主要風(fēng)味物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示。由圖1可知,碳水化合物代謝、氨基酸代謝是酸筍中微生物的2條主要代謝途徑,其中糖酵解、磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑以及三羧酸循環(huán)是醛類、酚類和各類氨基酸的主要來(lái)源,并且各氨基酸之間,酸、醛、酯之間也可相互轉(zhuǎn)化。

圖1 酸筍主要特征風(fēng)味物質(zhì)形成的代謝網(wǎng)絡(luò)圖[38]

3.1 碳水化合物代謝

竹筍中的葡萄糖、蔗糖、果糖是酸筍中微生物代謝的主要能量來(lái)源[39],糖酵解、糖異生途徑,丙酮酸代謝以及葡萄糖和蔗糖降解是最為活躍的3條代謝途徑。關(guān)倩倩[38]分析了酸筍宏基因組KEGG代謝通路,發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、克雷伯氏菌屬通過(guò)蔗糖磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、β-呋喃果糖苷酶等酶將蔗糖分解為葡萄糖。降解而來(lái)的單糖與竹筍原料中的葡萄糖成為糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑直接能量來(lái)源,其中糖酵解對(duì)酸筍風(fēng)味的形成至關(guān)重要。發(fā)酵前期,乳酸菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物。隨后,逐漸豐富的乳酸菌參與到糖酵解、丙酮酸代謝等途徑中,其中乳球菌屬、乳桿菌屬等同型發(fā)酵乳酸菌經(jīng)糖酵解途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,而魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等異型發(fā)酵乳酸菌則通過(guò)戊糖磷酸途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸、乙醇和CO2等代謝產(chǎn)物。此外,乳酸菌還能進(jìn)一步將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為酯類、酮類、醛類等其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

3.2 蛋白質(zhì)和氨基酸代謝

乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬和腸桿菌屬等具有蛋白質(zhì)水解活性,可將竹筍中的蛋白質(zhì)水解為肽和氨基酸,氨基酸也可由糖酵解、三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物或有機(jī)酸作為前體物質(zhì)合成。氨基酸又可進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)氨、脫羧、裂解等轉(zhuǎn)化為醛類、醇類等風(fēng)味物質(zhì)。SONAR等[40]測(cè)定了從傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍中分離的植物乳桿菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌、木糖乳桿菌等的蛋白質(zhì)水解性能及蛋白酶活性,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诿撝榄傊桨迳暇星逦睦业鞍姿鈪^(qū),其中木糖乳桿菌的蛋白酶活性高達(dá)64.2 nmol/mL。劉艷婷等[41]發(fā)現(xiàn)毛竹筍發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量從2.2 g/100 g降低到0.89 g/100 g,表明蛋白質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了降解,這也是生成風(fēng)味物質(zhì)的一條重要途徑。有研究報(bào)道纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下生成α-酮酸,之后經(jīng)α-酮酸脫羧酶作用轉(zhuǎn)化為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等醛類物質(zhì)及對(duì)應(yīng)的醇類物質(zhì),與之相關(guān)的微生物有乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬,其中乳球菌屬也對(duì)芳香族氨基酸表現(xiàn)出較高的活性[42]。

4 小結(jié)與展望

酸筍中以乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬等為代表的微生物在不同階段發(fā)生的演替決定著酸筍生產(chǎn)過(guò)程中的風(fēng)味形成,而風(fēng)味又是評(píng)價(jià)酸筍品質(zhì)的關(guān)鍵。因此,研究酸筍中微生物和風(fēng)味物質(zhì)及兩者的相關(guān)性逐漸成為酸筍研究的熱點(diǎn),未來(lái)可針對(duì)以下幾方面展開(kāi)探索：a)從傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍中分離出發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株制備直投式的酸筍專用復(fù)合發(fā)酵劑,提高發(fā)酵效率,從而用于酸筍的工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。b)目前酸筍中各類微生物的代謝通路并不明晰,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等解析不同微生物的完整代謝途徑及微生物的互作效應(yīng),揭示主要微生物的特定功效及其對(duì)不同風(fēng)味物質(zhì)形成的影響機(jī)制。c)對(duì)特征性風(fēng)味物質(zhì)形成具有較大影響的代謝微生物進(jìn)行基因改造,通過(guò)調(diào)節(jié)其產(chǎn)酶的類型及酶活力來(lái)定向調(diào)節(jié)特征性風(fēng)味物質(zhì)的含量,從而實(shí)現(xiàn)酸筍風(fēng)味品質(zhì)的定向調(diào)控。

酸筍作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品,其風(fēng)味獨(dú)特、口感豐富,被稱作螺螄粉的靈魂配料,深受人們的喜愛(ài)。以乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、腸桿菌屬等為主的乳酸菌通過(guò)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸以及豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),賦予酸筍獨(dú)特的風(fēng)味。因此,通過(guò)對(duì)酸筍中微生物演替和風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制的系統(tǒng)研究,將為高品質(zhì)酸筍的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化提供有益依據(jù)。