多級(jí)雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究

朱恒偉,白新鵬,*,梁秋楊,鐘瀧彬,常會(huì)敏,陳運(yùn)坤,喬振栓

1(海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 ?？?570203) 2(熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南 海口,570203) 3(?？谥仓厣镔Y源研究所有限公司,海南 海口,570100)

木瓜蛋白酶是一種分子質(zhì)量23.4 kDa,含有212個(gè)殘基的半胱氨酸內(nèi)肽酶,在pH 5～8有著較高的酶活性,最佳溫度為65 ℃,等電點(diǎn)值為8.75[1]。

木瓜蛋白酶普遍應(yīng)用于食品、飼料等行業(yè),如肉類嫩化[2]、乳品加工[3]、烘焙[1]、飼料[4]、牙齒美白[5]、治療燒傷和去除齲齒[6]等。

制作木瓜蛋白酶的傳統(tǒng)方法有鹽析法、有機(jī)溶劑法、超濾法、親和層析法等。鹽析法簡(jiǎn)單方便,但是最高只有39%的純度以及無法去除其他雜蛋白使得這種方法無法應(yīng)用于大規(guī)模及高純度木瓜蛋白酶的制作[7];有機(jī)溶劑法能獲得純度較高的木瓜蛋白酶,但酶活性回收率較低[8];超濾法由于濃差極化現(xiàn)象,會(huì)影響木瓜蛋白酶的萃取效果,并且無法分離分子質(zhì)量與木瓜蛋白酶分子質(zhì)量相近的酶[9];親和層析法要求前處理液必須經(jīng)過一定步驟的純化,且操作復(fù)雜,產(chǎn)量較低,不適合大規(guī)模生產(chǎn),優(yōu)點(diǎn)是純度較高[10]。

雙水相萃取(aqueous two-phase extraction, ATPE)在下游加工中表現(xiàn)出巨大的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì),具有巨大的應(yīng)用潛力。涉及分離、濃縮和純化的幾個(gè)階段可以減少并被ATPE取代,從而使整個(gè)回收過程更加節(jié)能、成本更低[11]。與傳統(tǒng)方法相比,使用ATPE進(jìn)行分離萃取具有許多優(yōu)點(diǎn),包括工藝簡(jiǎn)單、分離迅速、選擇性高、能耗低、成本低等[12],然而很少有研究以中試規(guī)模開發(fā)連續(xù)。多級(jí)ATPE使用最多的2種設(shè)備是混合沉淀柱和萃取柱,離心分離色譜法和逆流色譜法也被應(yīng)用于連續(xù)或半連續(xù)的ATPE[13]。

本課題組通過前期實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG6000)和檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)組成的雙水相體系相比于其他PEG-鹽體系在萃取木瓜蛋白酶方面有著更好的表現(xiàn)。本研究通過研究多級(jí)PEG6000-Na3C6H5O7雙水相體系萃取木瓜蛋白酶獲得理論萃取級(jí)數(shù)并設(shè)計(jì)出優(yōu)化的萃取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸鈉(Na3C6H5O7),上海麥克林生化科技有限公司;PEG6000,天津光復(fù)精細(xì)化研究所;木瓜蛋白酶,?？陟佩P科技有限公司;L-酪氨酸,上海源葉生物科技有限公司;三氯乙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250,西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-88B旋轉(zhuǎn)混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀,Thermo Fisher;752 N紫外分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋,常州凱航儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 木瓜蛋白酶活性測(cè)定

參考張興燦等[14]方法測(cè)定木瓜蛋白酶活性。

1.3.2 萃取級(jí)數(shù)對(duì)木瓜蛋白酶酶活性回收率的影響

參考BABALOLA等[15]方法將雙水相相比固定在0.5,分別進(jìn)行1～7級(jí)錯(cuò)流雙水相萃取,并與同萃取級(jí)數(shù)的逆流萃取相對(duì)比。每一級(jí)雙水相體系混合均勻并靜置完全分相后,測(cè)定每一級(jí)上相中的木瓜蛋白酶的酶活性回收率。

1.3.3 木瓜蛋白酶萃取平衡等溫線的繪制

參考RZIKI等[16]方法繪制萃取平衡等溫線。

1.3.4 多級(jí)逆流雙水相理論級(jí)數(shù)的計(jì)算

參考LIU等[17]方法和ROSA等[18]方法進(jìn)行多級(jí)逆流雙水相理論級(jí)數(shù)的計(jì)算。

1.3.5 PEG6000-Na3C6H5O7多級(jí)雙水相萃取木瓜蛋白酶

參考劉毅[19]方法分別使用多級(jí)錯(cuò)流和多級(jí)逆流雙水相方法萃取木瓜蛋白酶。

相比Vr計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

分配系數(shù)K計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

酶活性回收率Ye如公式(3)所示：

(3)

式中：Ct和Cb分別代表目標(biāo)物質(zhì)木瓜蛋白酶在雙水相體系在上、下相中的不同質(zhì)量濃度,mg/mL;Vt和Vb分別代表上相和下相的體積,mL;Et為上相酶活性濃度,U/mL;Me為加入系統(tǒng)酶的總活性,U。

2 結(jié)果與分析

2.1 相比對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響

如圖1所示,隨著雙水相兩相的體積比Vr從0.25增加到1.6,木瓜蛋白酶的酶活性回收率從71.52%增大至87.21%,分配系數(shù)從1.21增加至3.17,說明增加相比能顯著提高萃取效率。當(dāng)相比從1.6增加至2.0,分配系數(shù)和酶活性回收率均有所下降,這是因?yàn)镻EG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,導(dǎo)致上相濃度增加,空間阻力增加,木瓜蛋白酶的選擇性分配效果減弱[20]。

圖1 相比對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響

2.2 萃取級(jí)數(shù)對(duì)木瓜蛋白酶酶活性回收率的影響

在多級(jí)雙水相萃取中,如果在第一級(jí)沒有富集到很高的回收率是不重要的,因?yàn)榭梢酝ㄟ^增加萃取級(jí)數(shù)來進(jìn)行補(bǔ)償,且相比較高時(shí),會(huì)使更多的污染物從下相分配到上相,導(dǎo)致目標(biāo)物的純度降低[18],因此,選擇0.5的相比進(jìn)行多級(jí)雙水相的研究。由圖2可以看出,在同相比的條件下,隨著萃取級(jí)數(shù)的增加,多級(jí)錯(cuò)流和逆流雙水相都能夠較為顯著地提升木瓜蛋白酶的酶活性回收率。對(duì)于多級(jí)錯(cuò)流雙水相,經(jīng)過5級(jí)錯(cuò)流萃取后,木瓜蛋白酶的酶活性回收率達(dá)到了96.63%,6～7級(jí)的錯(cuò)流萃取略有下降。由圖2可知,在3級(jí)雙水相錯(cuò)流萃取后,酶活性回收率的增長(zhǎng)幅度明顯降低,僅增加了1.53%,這說明大部分的木瓜蛋白酶已在前3級(jí)完成萃取;多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的趨勢(shì)與錯(cuò)流相似,在第5級(jí)時(shí)達(dá)到最大酶活性回收率為97.92%,略高于同級(jí)數(shù)的錯(cuò)流萃取,且大部分的木瓜蛋白酶已在前3級(jí)被萃取出來。

圖2 相同相比條件下的多級(jí)錯(cuò)流萃取和多級(jí)逆流萃取

以上結(jié)果說明,在相比為0.5的條件下,通過多級(jí)錯(cuò)流或逆流萃取提高木瓜蛋白酶萃取率的方法是切實(shí)可行的,經(jīng)過5級(jí)錯(cuò)流雙水相萃取,木瓜蛋白酶的酶活性回收率增加了15.57%,經(jīng)過5級(jí)逆流雙水相萃取,酶活性回收率增加了18.19%。

2.3 多級(jí)錯(cuò)流雙水相對(duì)比多級(jí)逆流雙水相

如圖3所示,比較了0.3、0.5、0.7相比下五級(jí)錯(cuò)流雙水相萃取木瓜蛋白酶的差異,并與0.5相比下的5級(jí)逆流雙水相萃取進(jìn)行比較,可以發(fā)現(xiàn)相比增加和萃取級(jí)數(shù)增加都能使最終的酶活性回收率得到明顯提高。經(jīng)過五級(jí)錯(cuò)流萃取后,分別能達(dá)到90.41%、96.32%、95.38%的酶活性回收率,在相比0.5的條件下,5級(jí)逆流萃取后,酶活性回收率也達(dá)到了97.92%。

圖3 相同相比條件下的多級(jí)錯(cuò)流(Cro)萃取和多級(jí)逆流(Coun)萃取

圖4 木瓜蛋白酶的萃取平衡等溫線

由于多級(jí)錯(cuò)流萃取和多級(jí)逆流萃取原理上的差異,為了提高酶活性回收率,多級(jí)錯(cuò)流萃取每一級(jí)都要加入新的PEG萃取相。因此要想獲得同樣的酶活性回收率,多級(jí)錯(cuò)流萃取需要的PEG萃取劑的量要多于多級(jí)逆流萃取[19]。由圖2和圖3可知,相同相比和萃取級(jí)數(shù)條件下,多級(jí)逆流萃取的酶活性回收率要高于多級(jí)錯(cuò)流萃取,因此選擇多級(jí)逆流萃取進(jìn)行多級(jí)雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究。

2.4 萃取平衡等溫線的繪制

萃取平衡等溫線(extraction equilibrium isotherm)是雙水相萃取過程中的一個(gè)關(guān)鍵的萃取因素,能夠很好地反映出目標(biāo)物在平衡兩相之間的分配關(guān)系[21],并且可以用于模擬多級(jí)萃取的級(jí)數(shù)及相關(guān)規(guī)律,最具代表性的就是McCabe Thiele圖解法[22]。表1是不同相比條件下,上相中木瓜蛋白酶的濃度(Ct)和下相中木瓜蛋白酶的濃度(Cb)。因?yàn)樵陔p水相萃取過程中,上相PEG的質(zhì)量以及下相檸檬酸鈉的質(zhì)量均為常量,所以可以下相中木瓜蛋白酶濃度Cb為橫坐標(biāo),上相中木瓜蛋白酶的濃度Ct為縱坐標(biāo)繪制曲線,即為萃取平衡等溫線。得到的擬合曲線方程為Y=0.689 58-0.696 85×exp(-X/0.051 01),其中R2=0.994 2,AdjR2=0.991 9。

表1 不同相比下木瓜蛋白酶雙水相在上下相的質(zhì)量濃度Table 1 Concentration of papain in top and bottom phase at different volume ratio

2.5 多級(jí)逆流雙水相的模擬計(jì)算

在這個(gè)過程中假設(shè)各級(jí)加入的PEG用量相同,與下相互溶度很小,且雙水相完全分相后只有上相及下相2個(gè)部分,萃取過程中沒有發(fā)生熱效應(yīng)。參考ROSA等[18]方法,對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行物料衡算可得：

VBP×[Solute]BP inlet+VTP×[Solute]TP inlet=VBP×[Solute]BP outlet+VTP×[Solute]TP outlet

(4)

進(jìn)而可得操作線方程為：

(5)

式中：[Solute]BP inlet和[Solute]BP outlet表示系統(tǒng)中各級(jí)雙水相上相和下相的木瓜蛋白酶的質(zhì)量濃度,mg/mL;VBP表示下相的體積,mL;VTP表示上相的體積,mL。

圖5 多級(jí)逆流萃取在X-Y坐標(biāo)上圖解理論級(jí)數(shù)

使用McCabe Thiele圖解法可以得到多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論萃取級(jí)數(shù)。由圖6可以看出,在原料液下相的木瓜蛋白酶的初始質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的情況下,當(dāng)相比為0.5時(shí),即操作線1,此時(shí)多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級(jí)數(shù)為3;當(dāng)相比為0.25時(shí),即操作線2,此時(shí)多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級(jí)數(shù)為4。

圖6 多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級(jí)數(shù)

2.6 多級(jí)雙水相萃取工藝設(shè)計(jì)

將上述理論級(jí)數(shù)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果如表2所示。經(jīng)3級(jí)逆流雙水相萃取后,木瓜蛋白酶的酶活性回收率達(dá)到了96.75%。由此可得多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的預(yù)測(cè)優(yōu)化方案,如圖7所示。

表2 0.5相比下3級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的酶活性回收率Table 2 Enzyme activity recovery rate of papain in three-stage countercurrent ATPE at 0.5 volume radio

圖7 相比0.5條件下的3級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的預(yù)測(cè)優(yōu)化方案

3 結(jié)論

本文探究了多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的理論級(jí)數(shù),結(jié)果表明,當(dāng)相比為0.5,原料液下相的木瓜蛋白酶的初始質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí),使用3級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的酶活性回收率達(dá)到了96.75%,并設(shè)計(jì)出多級(jí)逆流雙水相萃取木瓜蛋白酶的優(yōu)化方案,對(duì)多級(jí)雙水相萃取木瓜蛋白酶的方法在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用具有一定的意義。