miR-146a通過TGF-β1/SMAD通路調(diào)控脊柱結(jié)核進(jìn)展的分子機(jī)制

李小鵬 厲鋒 董陽 張揚(yáng) 趙曉棟 張驍 孫泉 王軍 陳高揚(yáng)

脊柱結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核，可破壞病人椎體與椎間盤，進(jìn)而形成流注膿腫，常并發(fā)脊柱畸形與截癱，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量［1-3］。脊柱結(jié)核最重要的特征性改變是椎間盤破壞［4］，但其破壞機(jī)制不明確。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是調(diào)控椎間盤代謝的重要因子，可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)膠原蛋白的降解，導(dǎo)致椎間盤破壞，同時(shí)對(duì)椎間盤細(xì)胞基質(zhì)的合成與增殖起重要調(diào)節(jié)作用［5-6］。在脊柱結(jié)核的相關(guān)研究中，有學(xué)者報(bào)道TGF-β1能夠促使細(xì)胞內(nèi)結(jié)核桿菌大量繁殖，降低單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，其大量聚集時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)及骨質(zhì)破壞、空洞和纖維化［7］。可見TGF-β1 在脊柱結(jié)核破壞的病理過程中起著重要的作用，但導(dǎo)致TGF-β1在脊柱結(jié)核中表達(dá)失衡的機(jī)制尚不明確。

微小RNA（miRNA）被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄后水平關(guān)鍵調(diào)控因子，其可通過調(diào)控目標(biāo)mRNA 的水平參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響生理和病理過程［8-9］。近年來，miR-146a被證實(shí)是重要的調(diào)控性非編碼RNA，其在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、腫瘤、骨與軟骨代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用［10］。有研究提示miR-146a 通過靶向母親抗肢癱同系物4（SMAD4）調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)，調(diào)控疾病進(jìn)展［11-12］。TGF-β1 主要通過與其特異性受體結(jié)合激活SMAD 同系物2（SMAD2）、SMAD 同系物3（SMAD3）蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，且通過SMAD4、SMAD同系物7（SMAD7）蛋白的調(diào)控激活或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮生物學(xué)作用，研究顯示SMAD4在TGF-β1/SMAD信號(hào)通路占據(jù)著核心地位，是信號(hào)傳導(dǎo)過程中共同需要的介質(zhì)［7］。因此，我們提出假設(shè)：miR-146a 通過結(jié)合SMAD4 調(diào)控TGF-β1/SMAD 通路，進(jìn)而調(diào)控脊柱結(jié)核進(jìn)展。

在本文中，我們擬探究miR-146a是否通過介導(dǎo)TGF-β1/SMAD通路調(diào)控脊柱結(jié)核進(jìn)展，以期為深入了解脊柱結(jié)核發(fā)生發(fā)展提供新的見解，以及為脊柱結(jié)核的防治提供新的策略。

材料與方法

一、標(biāo)本收集

試驗(yàn)對(duì)象為在濰坊市人民醫(yī)院脊柱外科行脊柱結(jié)核病灶清除手術(shù)及脊柱外傷手術(shù)可取得的髓核及血液標(biāo)本的病人，遵循其知情同意。在取得病人的知情同意書后方能入組，其中結(jié)核組病人10 例，男5，女5，年齡為（34.2±10.3）歲；外傷對(duì)照組病人10例，男5，女5，年齡為（32.1±14.0）歲。

入組標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核組根據(jù)術(shù)前影像學(xué)（圖1）及臨床癥狀，術(shù)后的組織病理檢查等明確診斷，排除其他疾病。對(duì)照組病人排除脊柱其他感染性疾病、腫瘤及免疫學(xué)疾病等。本實(shí)驗(yàn)所有臨床標(biāo)本均根據(jù)《赫爾辛基宣言》經(jīng)病人及家屬同意后采集，研究方案獲得濰坊人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：KYLL20190412-1）。

圖1 CT 檢查矢狀位（a）和水平位（b）所示結(jié)核感染椎間盤及椎體骨破壞

二、試劑與儀器

由武漢普諾賽生命科技有限公司購得人椎間盤髓核細(xì)胞完全培養(yǎng)基，由中國漢恒生物科技有限公司購得miR-146a 的抑制劑（inhibitor，序列為：5'-AACCCAUGGAAUUCAGUUCUCA - 3'）、模 擬 物（mimics，序列為：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'，5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3'）以及野生型和突變型（miR-146a 結(jié)合位點(diǎn)突變）SMAD4序列的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，由日本TAKARA 公司購得PrimeScript RT 試劑，由中國碧云天購得RIPA 裂解緩沖液、PBS 溶液、ELC 顯色液，由美國Invitrogen 購得liposome 2000、Trizol 試劑和蛋白第二抗體，由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成熒光定量PCR 引物（表1），由美國Signalway Antibody 公司購得蛋白提取試劑盒，由英國Abcam公 司 購 得GAPDH（ab9485；1∶5 000）、SMAD2（ab280888；1∶1 000）、SMAD3（ab40854；1∶1 000）、SMAD4（ab40759；1∶1 000）、SMAD7（ab216428；1∶1 000）抗體。由美國菌種保藏中心購得293T細(xì)胞，由美國Applied Biosystems 購得StepOne Plus 熒光定量PCR儀，由美國ThermoFisher公司購得酶標(biāo)儀，由德國Leica公司購得倒置熒光顯微鏡。

表1 本研究中使用的引物序列

三、細(xì)胞分離與培養(yǎng)

結(jié)核組病人和對(duì)照組病人椎間盤髓核細(xì)胞的分離方法參照前期文獻(xiàn)［13］，細(xì)胞培養(yǎng)在人椎間盤髓核細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（5%CO2，37 ℃），每3天更換培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞擴(kuò)增至80%，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

四、構(gòu)建miR-146a的抑制劑和模擬物及細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

由漢恒生物構(gòu)建miR-146a 的抑制劑（inhibitor）和模擬物（mimics），用于細(xì)胞水平敲低和過表達(dá)miR-146a。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟簡述如下：將脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞均勻鋪種于12孔板或96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)50%，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，應(yīng)用liposome 2000 將miR-146a mimics（mimics 組）和miR-146a inhibitor（inhibitor 組）轉(zhuǎn)染進(jìn)入脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置control組，6小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

五、增殖實(shí)驗(yàn)

將結(jié)核組和對(duì)照組髓核細(xì)胞、敲低/過表達(dá)miR-146a 脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞鋪種于96 孔板（100 μL/孔），然后將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。24小時(shí)后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h 后，上清液轉(zhuǎn)入新的96 孔板中，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、遷移實(shí)驗(yàn)

將結(jié)核組和對(duì)照組髓核細(xì)胞、敲低/過表達(dá)miR-146a脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞鋪種于12孔板，待細(xì)胞貼壁后，應(yīng)用直尺和20 μL槍頭均勻地劃橫線，寬度約500 μm，PBS 清洗劃除的細(xì)胞后，培養(yǎng)皿放置于37 ℃，2%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24、48 h后拍照并計(jì)算劃痕處細(xì)胞相對(duì)位移，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)位移計(jì)算細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞遷移率=（初始劃痕寬度-24/48小時(shí)后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

七、RNA表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用TRIZOL 法提取結(jié)核組病人和對(duì)照組病人髓核組織及外周血、敲低和過表達(dá)miR-146a脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞的總RNA，然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用StepOnePlus定量PCR系統(tǒng)通過熒光定量PCR 擴(kuò)增cDNA。U6 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）分別用作miRNA 和mRNA 的內(nèi)部參考基因。

八、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

使用蛋白提取試劑盒提取結(jié)核組病人和對(duì)照組病人髓核組織、敲低和過表達(dá)miR-146a脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞的總蛋白，將變性蛋白在SDS-PAGE 凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。接下來，將PVDF 膜 與GAPDH（ab9485；1∶5 000）、SMAD2（ab280888；1∶1 000）、SMAD3（ab40854；1∶1 000）、SMAD4ab40759；1∶1 000）、SMAD7（ab216428；1∶1 000）抗體在4°C下孵育過夜后，將PVDF膜與相應(yīng)的第二抗體（A32731）在25 ℃下培養(yǎng)1小時(shí)。最后，將ECL顯色溶液添加到PVDF膜中以顯示蛋白質(zhì)帶。

九、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將293T 細(xì)胞接種到96 孔板，由漢恒生物構(gòu)建野生型和突變型（miR-146a 結(jié)合位點(diǎn)突變）SMAD4序列的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒分別與miR-146a mimics 或mimics control 轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，設(shè)置單純轉(zhuǎn)染螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為對(duì)照組。同時(shí)，向每組中加入等量海參熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為參照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)兩種熒光活性，并計(jì)算相對(duì)熒光活性。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)描述為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，通過GraphPad Prism 7.5（GraphPad Software，美國）進(jìn)行分析和可視化。使用學(xué)生Student t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析分子之間表達(dá)的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、結(jié)核感染椎間盤細(xì)胞增殖和遷移能力變化

通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)核組病人的髓核細(xì)胞24 h和48 h 的遷移率顯著低于對(duì)照組病人的髓核細(xì)胞（圖2 a、b），同時(shí)CCK-8實(shí)驗(yàn)提示結(jié)核組病人髓核細(xì)胞的增殖活性顯著低于對(duì)照組病人（圖2 c）。上述結(jié)果提示結(jié)核感染可導(dǎo)致髓核細(xì)胞的遷移及增殖活性顯著減弱。

圖2 結(jié)核組病人的髓核細(xì)胞增殖（a、b）和遷移能力（c）顯著減低，和對(duì)照組比較，***P＜0.001

二、miR-146a在結(jié)核病人組織中表達(dá)量鑒定

miR-146a 在脊柱結(jié)核病人的髓核組織中表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（差異倍數(shù)：0.55±0.24，P＜0.001，圖3 a），miR-146a 在脊柱結(jié)核病人的外周血中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（差異倍數(shù)：0.56±0.36，P＜0.05，圖3 b），提示miR-146a表達(dá)量與脊柱結(jié)核的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。

圖3 miR-146a在脊柱結(jié)核病人髓核組織（a）和外周血（b）中表達(dá)量顯著減低，和對(duì)照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

三、SMAD 通路在髓核組織中的表達(dá)水平與miR-146a表達(dá)量相關(guān)性檢測(cè)

我們進(jìn)一步檢測(cè)了Smad 通路關(guān)鍵基因及蛋白在結(jié)核組病人和對(duì)照組病人髓核組織中的表達(dá)量，PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)髓核組織中SMAD2（差異倍數(shù)：2.58±2.19，P＜0.05）、SMAD3（差異倍數(shù)：9.69±4.44，P＜0.001）、SMAD4（差異倍數(shù)：10.11±6.48，P＜0.001）、TGF-β1 mRNA（差異倍數(shù)：5.26±1.66，P＜0.001）在脊柱結(jié)核病人髓核組織中的表達(dá)量顯著增高，而SMAD7 mRNA（差異倍數(shù)：0.47±0.33，P＜0.01）表達(dá)顯著減低（圖4 a），Western blot結(jié)果提示蛋白表達(dá)趨勢(shì)與qPCR一致（圖4 b、c）。上述結(jié)果提示miR-146a表達(dá)量與SMAD2、SMAD3、SMAD4、TGF-β1 顯著負(fù)相關(guān)，而與SMAD7呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果提示在髓核組織中，SMAD 通路活性與miR-146a 顯著負(fù)相關(guān)，在髓核細(xì)胞中miR-146a對(duì)SMAD 通路可能具有抑制作用。

圖4 SMAD通路關(guān)鍵基因mRNA（a）和蛋白（b、c）在脊柱結(jié)核髓核組織中表達(dá)量鑒定，和對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

四、miR-146 靶向Smad4 調(diào)控SMAD/TGF-β1 通路鑒定

已有研究提示miR-146a可靶向結(jié)合SMAD4 3’-UTR 端進(jìn)而抑制其表達(dá)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中構(gòu)建了包含SMAD4 3’-UTR端野生型或突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（圖5 a），并與miR-146a mimics共同轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，SMAD4 3’-UTR 端野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-146a mimics共同轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光活性顯著減低，而SMAD4 3’-UTR 端野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與mimics 對(duì)照組，以及SMAD4 3’-UTR 端突變型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-146a mimics 或mimics 對(duì)照組熒光活性無明顯變化，提示miR-146a mimics可靶向識(shí)別SMAD4 3’-UTR 端（圖5 b）。為了進(jìn)一步明確miR-146a 在髓核細(xì)胞中對(duì)SMAD 通路的調(diào)控作用，我們通過體外實(shí)驗(yàn)在脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-146a（圖6 a），并檢測(cè)SMAD/TGF-β1 通路表達(dá)變化，結(jié)果提示過表達(dá)miR-146a 可顯著下調(diào)SMAD2、SMAD3、SMAD4和TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，但可上調(diào)SMAD7表達(dá)水平；相反，敲低miR-146a 可顯著上調(diào)SMAD2、SMAD3、SMAD4 和TGF-β 1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，但可下調(diào)SMAD7 表達(dá)水平（圖6 b～d）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-146a在髓核細(xì)胞中可調(diào)控SMAD/TGF-β1通路。

圖5 SMAD4 3’-UTR端miR-146a結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)（a）及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證（b），和對(duì)照組比較，***P＜0.001

圖6 敲低/過表達(dá)miR-146a（a）對(duì)SMAD通路關(guān)鍵基因mRNA（b）和蛋白（c、d）表達(dá)影響，和對(duì)照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

五、miR-146a調(diào)控脊柱結(jié)核髓核細(xì)胞增殖及分化作用及機(jī)制鑒定

我們同時(shí)驗(yàn)證了過表達(dá)或敲低miR-146a 對(duì)脊柱結(jié)核病人髓核細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，結(jié)果提示：相較于control組，過表達(dá)miR-146a（mimics組）可顯著促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖及遷移活性并降低其凋亡活性，而敲低miR-146a（inhibitor 組）可顯著降低髓核細(xì)胞增殖及遷移活性并促進(jìn)其凋亡活性（圖7 a～c），上述結(jié)果提示miR-146a是促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖及遷移活性的關(guān)鍵因子。

圖7 敲低/過表達(dá)miR-146a對(duì)結(jié)核髓核細(xì)胞遷移（a、b）和增殖（c）影響，和對(duì)照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

討 論

脊柱是全身骨關(guān)節(jié)結(jié)核最易發(fā)生的部位，其中以椎體結(jié)核占大多數(shù)［3］。研究表明，結(jié)核感染可致椎間盤髓核破壞，是造成椎間盤破壞的重要因素［14］。

miR-146a 的編碼基因位于人類5 號(hào)染色LOC285628 基因上的第二外顯子，miR-146a 功能極其強(qiáng)大，是首個(gè)具有免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的miRNA，其主要作用是負(fù)性調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等多種免疫性疾?。?5-16］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)miR-146a 表達(dá)量在脊柱結(jié)核中顯著減低，提示其可能與脊柱結(jié)核進(jìn)展相關(guān)，但其可能參與的機(jī)制仍鮮有研究報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸可誘導(dǎo)miR-146a通過靶向SMAD4調(diào)節(jié)急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖［17］。Liu等［18］的研究發(fā)現(xiàn)miR-146a通過靶向調(diào)控SMAD4進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β1 誘導(dǎo)人上皮成纖維細(xì)胞分化。上述所有的文獻(xiàn)均揭示了SMAD4 是miR-146a 的標(biāo)靶蛋白。TGF-β1/SMAD 通道是脊柱結(jié)核椎間盤破壞發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)通路，研究報(bào)道高劑量TGF-β1可通過結(jié)合特異性受體激活SMAD2、SMAD3蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而通過調(diào)控髓核細(xì)胞代謝促進(jìn)髓核退變［5，19-20］。SMAD4在TGF-β1/SMAD信號(hào)通路占據(jù)著核心地位，SMAD4 是促進(jìn)SMAD2/3 蛋白入核過程中的關(guān)鍵介質(zhì)，而SMAD7 在此過程中發(fā)揮抑制作用［5，19-20］。同時(shí)，目前已有證據(jù)證明SMAD4 與椎間盤退變密切相關(guān)，在椎間盤退變組織中的表達(dá)明顯高于正常椎間盤組織［21］，而miR-146a 是SMAD4 的關(guān)鍵抑制劑，因此我們推測(cè)miR-146a在脊柱結(jié)核中是否可通過TGF-β1/Smads 通路調(diào)控脊柱結(jié)核髓核退變（圖8）。

圖8 miR-146a調(diào)控TGF-β1/SMAD通路示意圖（繪圖作者：陳高揚(yáng)）

在我們的研究中，我們首先通過相關(guān)性分析證實(shí)miR-146a 表達(dá)量與SMAD2、SMAD3、SMAD4 和TGF-β1 表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與SMAD7 呈正相關(guān)，提示miR-146a 對(duì)TGF-β1/SMAD 通路具有抑制作用。進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-146a可顯著抑制TGF-β1/SMAD 通路活性并促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖、遷移并抑制凋亡，而敲低miR-146a 結(jié)果相反，進(jìn)一步證實(shí)miR-146a可通過抑制TGF-β1/SMAD通路促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖及遷移活性。

當(dāng)然，本研究仍存在一定的不足。一方面，本研究僅用PCR 法檢測(cè)了miR-146a 在結(jié)核病人外周血及滑膜組織中的表達(dá)量，未能在組織水平對(duì)miR-146a進(jìn)行免疫熒光原位雜交定位，以及miR-146a與組織標(biāo)本中相關(guān)分子免疫組化的關(guān)聯(lián)研究；另一方面，本研究基于樣本檢測(cè)解釋了miR-146a在脊柱結(jié)核組織中的表達(dá)趨勢(shì)，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-146a 對(duì)TGF-β1/SMAD 通路活性及髓核細(xì)胞增殖及遷移活性的調(diào)控作用，但由于脊柱結(jié)核動(dòng)物模型造模難度較大，因此并未能從動(dòng)物水平闡明miR-146a對(duì)脊柱結(jié)核的治療功效。因此，未來仍需開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討miR-146a 在治療脊柱結(jié)核中的應(yīng)用前景。

綜上所述，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a 是脊柱結(jié)核進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，其可通過抑制TGFβ1/SMAD 通路活性進(jìn)而調(diào)控髓核細(xì)胞增殖及遷移活性，本研究為深入了解脊柱結(jié)核發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的見解，同時(shí)為脊柱結(jié)核的治療提供新思路。