N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物的合成及殺菌活性

張 勇, 時錦超, 胡 勇, 廖 燦, 王美美, 朱 祥,3, 余林花*, 李俊凱*

(1.長江大學 農(nóng)學院,湖北 荊州 434025; 2. 長江大學 農(nóng)藥研究所,湖北 荊州 434025; 3. 貴州大學 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地/教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

近年來,由于氣候變化加劇,作物真菌病害在我國的發(fā)生越來越嚴重。真菌病害因具有很強的暴發(fā)性和傳染性,易使農(nóng)作物大面積減產(chǎn),造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-6]。目前,使用化學殺菌劑對作物真菌病害進行防治,仍然是最為經(jīng)濟、有效的手段。然而,由于傳統(tǒng)殺菌劑的長期使用,在保障糧食產(chǎn)量和品質(zhì)的同時,化學農(nóng)藥的殘留、抗性和再猖獗等問題也日益突出。因此,設(shè)計以天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為先導,進行結(jié)構(gòu)修飾改造或?qū)⒒钚越Y(jié)構(gòu)單元引入天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中,是開發(fā)高效、低毒新型殺菌劑最有效的方式之一。

噻唑(圖1, Thiazole)是同時含有氮、硫原子的五元芳香雜環(huán),易與金屬離子配位,也可同其它有機分子形成氫鍵,因此具有生物活性廣泛的特點。Thiasporine A(圖1)作為一種含有噻唑雜環(huán)的天然產(chǎn)物,于2015年[7]首次由MACMILLAN課題組從海洋放線菌ActinomycetosporachloraSNC-032的代謝產(chǎn)物中分離得到。含噻唑結(jié)構(gòu)的化合物具有抗菌、殺蟲和抗腫瘤等生物活性,在農(nóng)用活性中已被開發(fā)為除草劑、殺蟲劑等,如目前已經(jīng)上市的殺菌劑噻唑菌胺(圖1, Ethaboxam)與殺蟲劑噻蟲嗪(圖1, Thiamethoxam)。本課題在前期的研究中[8]通過對Thiasporine A的殺菌、除草和殺蟲等活性進行篩選發(fā)現(xiàn),該類結(jié)構(gòu)具有較好的殺真菌活性;由初步構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn),無取代的苯基噻唑結(jié)構(gòu)具有更好的殺菌活性,可作為殺菌先導結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。與此同時,酰胺結(jié)構(gòu)(圖1, Amide)作為具有多種優(yōu)良生物活性的結(jié)構(gòu)片段,廣泛存在于農(nóng)藥和醫(yī)藥中,尤其在農(nóng)用殺菌劑領(lǐng)域中廣泛存在,如殺菌劑氟酰胺(圖1, Flutolanil)、呋吡菌胺(圖1, Furametpyr)和啶酰菌胺(圖1, Boscalid)。

圖1 含噻唑環(huán)/酰胺化學結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物和農(nóng)藥Figure 1 Natural products and pesticides containing thiazole ring/amide chemical structure

基于以上結(jié)果,本研究以Thiasporine A中的殺菌活性結(jié)構(gòu)苯基噻唑為先導,設(shè)計合成了一系列含酰胺結(jié)構(gòu)的苯基噻唑類衍生物(圖2～3),并測定了化合物對6種植物病原真菌的離體殺菌活性,以期得到具有較高殺菌活性的化合物。通過探討N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物的構(gòu)效關(guān)系,旨在為今后苯基噻唑類衍生物的殺真菌活性研究提供理論依據(jù)。

圖2 目標化合物的設(shè)計思路Figure 2 Design idea of the target compounds

圖3 目標化合物(6a～6l)的合成路線Figure 3 Synthesis route of target compounds(6a～6l)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRR型熔點儀(上海精密科學儀器有限公司); Q Exactive型高分辨質(zhì)譜儀(德國,賽默飛公司); Bruker AV 400型核磁共振儀(內(nèi)標為TMS,溶劑為CDCl3和DMSO-d6); Digital water bath SB-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)。

所有化學藥品均為市售國產(chǎn)試劑,除特別注明外,未經(jīng)進一步處理,直接使用。苯甲腈,上海麥克林生化科技有限公司; 3-溴丙酮酸乙酯,質(zhì)量分數(shù)為80%,上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司; 不同取代苯胺,質(zhì)量分數(shù)為99%,上海麥克林生化科技有限公司。薄層和柱層析用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

1.2 供試真菌

水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani、白芨白絹病菌Sclerotiumrolfii、水稻稻瘟病菌Magnaportheoryzae、柑橘黑點病菌Phomacitricarpa、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum和煙草赤星病菌Alternariaalternata均由長江大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供。

1.3 化合物的合成

(1) 化合物2的合成

參照文獻[7]方法,將MgCl2·6H2O(21.7 g, 110.0 mmol)和苯甲腈(10.0 g, 100.0 mmol)分別加入250 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。室溫攪拌15 min后,將NaHS·H2O(12.0 g, 210.0 mmol)加入反應液,持續(xù)室溫攪拌16 h。監(jiān)測反應完成后,反應液用水(70 mL)和飽和食鹽水(10 mL)稀釋,并用乙酸乙酯(4×50 mL)萃取。合并的有機相用飽和食鹽水(3×50 mL)洗滌并用無水硫酸鈉干燥,得到粗產(chǎn)物化合物2。

(2) 化合物3的合成

參照文獻[9]方法,將硫代苯甲酰胺(15.0 g, 110.0 mmol), 250 mL無水乙醇加入到1000 mL圓底燒瓶,攪拌至完全溶解,室溫下用恒壓滴定管緩慢滴加80% 3-溴丙酮酸乙酯(29.5 g, 120.0 mmol),室溫下反應0.5 h后,加熱回流2 h,監(jiān)測至反應結(jié)束。向反應液中加入飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH=8～9,減壓蒸餾后加CH2Cl2溶解,加入飽和食鹽水進行交叉萃取,用無水硫酸鈉干燥,脫溶劑得到化合物2的粗產(chǎn)品。隨后通過柱層析純化(洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V),得到化合物3。

(3) 化合物4的合成

將化合物2和溶解在水中的NaOH(4.8 g, 120.0 mmol)依次加入圓底燒瓶中,加熱回流反應5 h,監(jiān)測至反應結(jié)束。向反應液中加入稀鹽酸調(diào)節(jié)pH=4～5,攪拌0.5 h后,加水析出白色固體,抽濾得到濾餅,即化合物3的純品(4)[6]。

(4) 目標化合物6a～6l的合成

參照文獻[10-11]方法,將6.0 mmol化合物3加入含有50 mL CH2Cl2的圓底燒瓶中,用恒壓滴定管緩慢滴加二氯亞砜,隨后滴加2滴DMF,待體系穩(wěn)定后升溫反應2 h。監(jiān)測至反應結(jié)束后,將反應液旋干并加入20 mL CH2Cl2溶解。冰浴條件下加入不同取代苯胺(6.6 mmol),同時加入三乙胺(6.6 mmol)作為縛酸劑,在室溫下反應6 h。反應結(jié)束后,向反應液中加入稀鹽酸調(diào)pH=5～6,加入飽和食鹽水和反應液進行交叉萃取,合并有機層,干燥,減壓濃縮得粗品,經(jīng)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯 ∶石油醚=5 ∶1,V∶V)純化,得到目標化合物6a～6l。

N-(2-乙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6a):棕色固體,產(chǎn)率56.1%, m.p.124～126 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.49(s, 1H), 8.23(m, 2H), 7.99(dd,J=6.8 Hz,J=3.2 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.29(m, 2H), 7.14(t,J=8.0 Hz, 1H), 2.80(q,J=7.6 Hz, 2H), 1.38(t,J=7.6 Hz, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.15, 158.82, 151.13, 135.21, 133.72, 132.70, 130.80, 129.17, 128.75, 126.92, 126.55, 124.93, 123.32, 121.83, 24.68, 13.98; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C18H16N2OS{[M+H]+}309.1056, found 309.1051。

N-(4-乙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6b):棕紅色液體,產(chǎn)率91.2%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.17(d,J=12.6 Hz, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.66(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.48(m, 3H), 7.22(d,J=8.4 Hz, 2H), 2.66(q,J=7.6 Hz, 2H), 1.25(t,J=7.6 Hz, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.21, 158.76, 150.95, 140.50, 135.27, 132.68, 130.76, 129.02, 128.39, 126.96, 126.68, 123.47, 119.91, 28.34, 15.63; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C18H16N2OS{[M+H]+}309.1056, found 309.1051。

N-(2-異丙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6c):棕黃色固體,產(chǎn)率58.1%, m.p.119～121 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.50(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.14(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.99(dd,J=6.4 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.51(m, 3H), 7.34(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.29(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.20(t,J=7.2 Hz, 1H), 3.24(dt,J=13.6 Hz, 6.8 Hz, 1H), 1.38(d,J=6.8 Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.16, 158.97, 151.13, 138.85, 134.34, 132.71, 130.79, 129.17, 126.55, 125.63, 125.38, 123.34, 122.81, 28.35, 22.79; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C19H18N2OS{[M+H]+}323.1213, found 323.1210。

N-(4-異丙基苯胺)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6d):棕紅色液體,產(chǎn)率67.3%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.18(d,J=13.2 Hz, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.26(s, 1H), 7.24(s, 1H), 2.92(dt,J=13.6 Hz, 6.8 Hz, 1H), 1.27(d,J=6.8Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.24, 158.78, 150.97, 145.17, 132.70, 130.73, 129.04, 126.98, 126.71, 123.50, 119.94, 33.64, 24.03; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C19H18N2OS{[M+H]+}323.1213, found 323.1207。

N-(4-叔丁基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6e):黃色液體,產(chǎn)率51.9%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.19(s, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 3.2 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H), 1.32(d,J=16.8 Hz, 9H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.25, 158.80, 150.96, 147.43, 135.02, 132.70, 130.79, 129.13, 128.33, 126.71, 125.91, 123.53, 119.62, 34.42, 31.37; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C20H20N2OS{[M+H]+}337.1369, found 337.1359。

N-(3-氯苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6f):白色固體,產(chǎn)率55.6%, m.p.102～103 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.32(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(m, 2H), 7.86(t,J=2.0 Hz, 1H), 7.62(dd,J=8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.51(m, 3H), 7.31(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.14(ddd,J=8.0 Hz, 2.0 Hz, 0.8 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.48, 158.86, 150.41, 138.81, 134.75, 132.53, 130.92, 130.08, 129.16, 126.71, 124.46, 124.04, 119.84, 117.76; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11ClN2OS{[M+H]+}315.0353, found 315.0350。

N-(4-氯苯胺)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6g):白色固體,產(chǎn)率68.8%, m.p.113～115 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.31(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(dd,J=6.8, 3.2 Hz, 2H), 7.72(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.51(m, 3H), 7.36(d,J=8.8 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.46, 158.84, 150.51, 136.26, 132.56, 130.91, 129.40, 129.14, 126.71, 123.91, 121.02; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11ClN2OS{[M+H]+}315.0353, found 315.0349。

N-(3-溴基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6h):白色固體,產(chǎn)率57.0%, m.p.109～111 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.31(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(d,J=6.6 Hz, 3H), 7.69(m, 1H), 7.51(m, 3H), 7.29(m, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.50, 158.85, 150.40, 138.95, 132.53, 130.93, 130.39, 129.17, 127.39, 126.72, 124.05, 122.69, 118.25; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11BrN2OS{[M+H]+}358.9848, found 358.9846。

N-(4-溴基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6i):白色固體,產(chǎn)率56.3%, m.p.116～117 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.30(s, 1H), 8.20(s, 1H), 7.99(dd,J=6.7 Hz, 2.9 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.50(dd,J=6.2 Hz, 2.8 Hz, 5H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.46, 158.84, 150.50, 136.76, 132.55, 132.06, 130.91, 129.16, 126.71, 123.94, 121.34, 117.01, 112.25; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11BrN2OS{[M+H]+}358.9848, found 358.9846。

N-(3-氟苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6j):白色固體,產(chǎn)率59.6%, m.p.113～114 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.35(s, 1H), 8.22(s, 1H), 8.00(m, 2H), 7.72(dt,J=10.8 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.51(m, 3H), 7.35(ddd,J=14.4 Hz, 12.0 Hz, 7.6 Hz, 2H), 6.86(tdd,J=8.4 Hz, 2.4 Hz, 1.2 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.47, 158.88, 150.45, 139.23, 132.55, 130.92, 130.15, 129.17, 126.72, 124.03, 115.10, 111.25, 111.04, 107.40, 107.14; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11FN2OS{[M+H]+}299.0649, found 299.0645。

N-(4-硝基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6k):黃色固體,產(chǎn)率67.5%, m.p.129～131 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.40(dd,J=7.6 Hz, 2.0 Hz, 2H), 8.06(dd,J=7.6 Hz, 2.0 Hz, 2H), 7.52(m, 7H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 188.12, 173.80, 132.86, 131.92, 130.71, 130.36, 129.27, 128.69, 128.33, 127.48; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11N3O2S{[M+H]+}324.0448, found 324.0448。

N-(2-甲氧苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6l):白色固體,產(chǎn)率93.6%, m.p.110～111 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.96(s, 1H), 8.56(d,J=6.4 Hz, 1H), 8.19(s, 1H), 8.02(dd,J=6.4 Hz, 3.2 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.08(m, 2H), 6.95(d,J=8.0 Hz, 1H), 3.99(s, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.03, 158.82, 148.47, 130.69, 129.10, 127.55, 126.65, 123.99, 123.34, 121.13, 119.85, 110.09, 55.98; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C17H14N2O2S{[M+H]+}311.0849, found 311.0838。

1.4 生物活性測定

采用菌絲生長速率法[12-15]測定化合物6a～6l對6種植物病原真菌的離體殺菌活性,藥劑初篩濃度為0.200 mmol/L。操作方法為:將目標化合物溶解于0.5 mL 二甲基亞砜(DMSO)。用含有0.1%(質(zhì)量分數(shù))的吐溫80水溶液定容至50 mL,并加入到滅菌后的PDA培養(yǎng)基中,制成含藥培養(yǎng)基。在含藥培養(yǎng)基上接入菌餅,每個藥劑重復3次,以申嗪霉素為對照藥劑,以0.5 mL DMSO處理組為溶劑對照。將接種后的培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 ℃。待空白對照菌落長至接近2/3培養(yǎng)皿直徑時,以十字交叉法測定各處理菌落的直徑,并計算供試化合物對病原菌的生長抑制率。選擇在初篩濃度下對病原菌抑制率大于60%的化合物,測定EC50值。同樣采用菌絲生長速率法,操作方法同上,測定各濃度下目標化合物對供試植物病原菌的抑制率。采用軟件DPS計算EC50值和95%置信限。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成分析

本研究通過五步反應得到目標化合物6a～6l。以苯甲腈為原料,通過成環(huán),水解反應分別得到化合物2～4;進一步將化合物4與二氯亞砜反應得到相應的酰氯,此過程應保證在無水條件下進行;待反應結(jié)束后應迅速以二氯甲烷為溶劑,三乙胺為縛酸劑進行酰胺反應,此過程要求將酰氯緩慢滴加至苯胺溶液中。該反應在低溫條件下對反應有利,高于室溫時副產(chǎn)物增多?；衔锝Y(jié)構(gòu)均經(jīng)1H NMR,13C MNR和HR-MS(MSI)得到確證。

2.2 目標化合物的殺菌活性

離體殺菌活性測定結(jié)果如表1所示,結(jié)果表明,目標化合物對6種供試真菌均有一定的殺菌活性。在0.2 mmol/L濃度下,化合物6b、6c、6d、6e、6k和6l對水稻紋枯病菌的抑制率為57.0%～84.0%,其中6b和6k與對照藥劑申嗪霉素抑菌效果相當;化合物6a、6c和6l對水稻稻瘟病菌的抑制率分別為75.8%、 88.8%和91.6%,均略低于申嗪霉素。根據(jù)預實驗結(jié)果測定了殺菌活性較高化合物的EC50值。從表2數(shù)據(jù)可以看出,化合物6b對水稻紋枯病菌殺菌活性較強,EC50值為0.041 mmol/L,但殺菌活性低于對照藥劑申嗪霉素;化合物6c和6l對水稻稻瘟病病菌殺菌活性最強,EC50值分別為0.015 mmol/L和0.020 mmol/L,其毒力高于對照藥劑申嗪霉素。初步構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明,目標化合物對供試病菌的抑制活性與連接酰胺的苯環(huán)上取代基(R)的性質(zhì)有關(guān)。當取代基R為烷基(供電子基團)時,對位取代的總體活性要優(yōu)于鄰位取代的活性;當取代基R為鹵素原子時,其對水稻紋枯的抑制率較優(yōu),而總體活性則是對位取代更優(yōu)于鄰位和間位;對于取代基R為其它基團時,則有不同的抑制效果,如6k(R為吸電子基團)對水稻紋枯病菌具有良好抑制作用。

表1 目標化合物對6種植物病原真菌的抑制作用aTable 1 Inhibitory effects of target compounds on 6 plant pathogenic fungi

表2 部分目標化合物對供試病原菌的EC50值Table 2 EC50 values of partial target compounds against test phytopathogens

本研究以Thiasporine A中的殺菌活性結(jié)構(gòu)苯基噻唑為先導,將酰胺活性亞結(jié)構(gòu)單元引入到苯基噻唑分子骨架,設(shè)計合成了12個N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物(6a～6l)。殺菌活性結(jié)果表明:在0.200 mmol/L時,大部分化合物對水稻紋枯病菌表現(xiàn)出較好的殺菌活性,其中6b和6k抑制作用與對照藥劑申嗪霉素相當;化合物6c和6l對水稻稻瘟病菌表現(xiàn)出良好的殺菌活性,其EC50值均低于對照藥劑申嗪霉素,抑制作用高于對照藥劑,說明將酰胺活性亞結(jié)構(gòu)單元引入到苯基噻唑分子骨架上對生物活性有一定的改善作用,而其結(jié)構(gòu)的改造有待進一步研究。