煙草抗感南方根結(jié)線蟲(chóng)品種根部差異表達(dá)mRNA的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

陳小翔，張文軍，翟爭(zhēng)光，徐志強(qiáng)，劉化冰，鐘永健，江智敏*

(1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)開(kāi)發(fā)分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省煙草公司 長(zhǎng)沙市公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

煙草根結(jié)線蟲(chóng)病是世界各國(guó)煙草生產(chǎn)中的主要病害之一，尤其以南方根結(jié)線蟲(chóng)危害為重，給我國(guó)的煙草產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[1-3]，僅云南省發(fā)病面積就達(dá)到266.67 hm2，病毒造成煙葉減產(chǎn)達(dá)到30%～50%[4]。南方根結(jié)線蟲(chóng)病不僅能直接對(duì)煙草造成危害，使煙株萎蔫黃化，整株死亡，還會(huì)導(dǎo)致煙草青枯病、黑脛病、根黑腐病、鐮孢根腐病等病害的發(fā)生，從而降低了煙草品種的抗病性[5]。

受環(huán)境和經(jīng)濟(jì)因素的影響，我國(guó)大部分煙區(qū)無(wú)法采用水旱輪作的方式，選擇化學(xué)防治的方式，雖然見(jiàn)效快，但也導(dǎo)致了農(nóng)藥的殘留，進(jìn)而導(dǎo)致煙葉品質(zhì)的下降?；瘜W(xué)防治還會(huì)引起環(huán)境污染，不符合當(dāng)代“綠色農(nóng)業(yè)”的理念。不同煙草品種之間存在明顯的抗性差異，選育抗病品種是防治根結(jié)線蟲(chóng)病最有效的方法[6]。

目前，關(guān)于南方根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究有很多，一些植物中的抗性基因已經(jīng)被鑒定和定位，例如：番茄中的Mi基因[7]和辣椒中的Me基因[8]。但是有關(guān)煙草相關(guān)的抗性基因并未有相關(guān)的報(bào)道，不同抗性煙草品種之間差異很大，探索抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的分子機(jī)制有利于加強(qiáng)抗性基因的育種工作。關(guān)于不同煙草品種抗根結(jié)線蟲(chóng)感染機(jī)制的生物信息學(xué)研究甚少。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)用于研究模型和非模型物種等相關(guān)方面，例如：數(shù)據(jù)表達(dá)的準(zhǔn)確性、動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)能力、新基因的探索能力等，具有比微陣列分析更顯著的優(yōu)勢(shì)[9]。因此，本研究以抗病品種K326與感病品種長(zhǎng)脖黃為材料[10-11]，在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)研究，通過(guò)對(duì)兩種不同煙草品種進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，以深入闡述抗根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種抗感染的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本文所選用煙草(Nicotianatabacum)品種為K326(抗南方根結(jié)線蟲(chóng))和長(zhǎng)脖黃(感南方根結(jié)線蟲(chóng))。

1.2 試驗(yàn)方法

利用賽默飛RNA提取試劑盒提取煙苗葉片總RNA，樣品檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行mRNA的富集及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，利用Illumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

利用Cytoscape version.3.5.0軟件對(duì)煙草生物學(xué)過(guò)程GO分類和KEGG 通路富集進(jìn)行分析。

1.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

利用最新的多功能在線軟件NetworkAnalyst對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)侵染后煙草品種根部的DEGs進(jìn)行分析，構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)該軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)路徑和模塊之間的探索分析以及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。

1.3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與GO分類綜合分析

將PPI網(wǎng)絡(luò)中分析出的重要基因與GO分類分析出的重要基因進(jìn)行綜合分析，找出引起抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草與感南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種差異表達(dá)的重要基因與通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因的GO功能分類分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)GO功能分類分析，共篩選出474個(gè)顯著富集的通路，表1是GO功能(BP)分類中的差異基因顯著富集前9的通路，分別是regulation of cellular metabolic process(細(xì)胞代謝)，endosomal transport(胞內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn))，jasmonic acid mediated signaling pathway(茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)通路)，heterocycle metabolic process(雜環(huán)代謝)，gene silencing by RNA (RNA介導(dǎo)的基因沉默)，innate immune response(固有免疫應(yīng)答)，sugar mediated signaling pathway (糖介導(dǎo)的信號(hào)通路)，hormone mediated signaling pathway(激素介導(dǎo)的信號(hào)通路)，response to salt stress(鹽脅迫應(yīng)答)等，其中重要基因有：Dcl1，Ago1，Cpl，Tor，F(xiàn)ab1b，Trn1，Ago4，F(xiàn)ab1c，F(xiàn)ab1d，Arf9，Smg7，Rs41，Ermo2，Spk1，Cul2，Pab2，Sizi，Xrn4，Ein3，Dcl2，Dcl4，Glu1，Trx2。

表1 GO功能(BP)分類中差異基因顯著富集通路Top9Table 1 Significant enrichment pathway of differential genes in GO function (BP) classification Top9

2.2 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

圖1是包含差異表達(dá)基因以及相互作用關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)中最主要的子網(wǎng)絡(luò)(subnetwork)，并將subnetwork1的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)出為功能模塊圖(圖2)，由圖1、圖2看出Fab1家族的Fab1b、Fab1c、Fab1d蛋白基因，Dcl家族的Dcl1、Dcl2、Dcl4蛋白基因，Glu1等基因是重要功能蛋白基因。

紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)蛋白，綠色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)蛋白；顏色間差異代表基因表達(dá)水平差異程度，其中顏色越深代表基因表達(dá)水平差異越大；面積的大小代表互作程度的高低，其中面積越大表示互作程度越高。圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)中的subnetwork1Fig.1 Subnetwork1 in PPI network

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因

表2是Subnetwork中蛋白互作程度最高的5個(gè)Hub node，均來(lái)自于Subnerwork1且互作程度大于等于15的節(jié)點(diǎn)(Degree≥15)，這表明Acc1、Glt1、Shd、Glu1、Nrpe1這5個(gè)基因編碼蛋白與其他蛋白存在著較強(qiáng)相互作用，可能是與抗感染有關(guān)的關(guān)鍵蛋白。

表2 Subnetwork中蛋白互作程度最高的5個(gè)Hub nodeTable 2 The 5 Hub nodes with the highest degree of protein interaction in the subnetwork

2.4 篩選煙草抗南方根結(jié)線蟲(chóng)生物過(guò)程的重要通路及相關(guān)的關(guān)鍵基因

結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7個(gè)基因與其他基因存在較高程度相互作用，并且也顯著富集在相關(guān)通路中，顯示為關(guān)鍵基因。其中基因Dcl1參與到100多個(gè)通路中，基因Dcl2、Dcl4參與到50個(gè)以上通路中，基因Fab1c、Glu1、Fab1b、Fab1d參與到10個(gè)以上通路中。在PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，這些基因互作程度均大于5，且均在Subnetwork1中，所以這些基因極有可能是與煙草抗南方根結(jié)線蟲(chóng)相關(guān)的關(guān)鍵基因。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

南方根結(jié)線蟲(chóng)感染煙草是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，煙草根部被南方根結(jié)線蟲(chóng)感染后，基因表達(dá)量及相應(yīng)通路會(huì)發(fā)生變化，因此，研究引起抗病煙草與感病煙草功能差異的通路至關(guān)重要。細(xì)胞代謝是生物體一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)[12]，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，特別是在植物的抗病防御反應(yīng)中，會(huì)發(fā)生次級(jí)代謝，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物在植物的機(jī)體防御、信號(hào)傳導(dǎo)和生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用[13]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)抗感染煙草品種根部上調(diào)基因顯著富集在細(xì)胞代謝過(guò)程調(diào)節(jié)(regulation of cellular metabolic process)通路中，其中參與光反應(yīng)和氮同化[14]的基因Glu1(glutamate synthase 1)顯著上調(diào)，同時(shí)參與PPI網(wǎng)絡(luò)(subnetwork1，圖1)。基因Glu1被認(rèn)為參與光反應(yīng)為次生代謝提供能量促進(jìn)次級(jí)代謝合成異戊二烯類化合物(如萜類)、酚類化合物和含氮化合物(如生物堿)[15]，在植物防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[16]。在抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種中，基因Glu1上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞代謝功能加強(qiáng)，從而推測(cè)此煙草品種可以通過(guò)增強(qiáng)次級(jí)代謝作用產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而間接加強(qiáng)煙草根部防御功能，達(dá)到抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的目的。

核內(nèi)體在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17-18]，而細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸對(duì)維持細(xì)胞正常代謝及其他生理功能具有重要意義[19]。研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)抗感染煙草品種根部上調(diào)基因顯著富集在核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)(endosomal transport)通路。對(duì)于抗感染的煙草品種，核內(nèi)體功能加強(qiáng)，則說(shuō)明其物質(zhì)運(yùn)輸功能增強(qiáng)，從而推測(cè)該煙草品種可通過(guò)增強(qiáng)物質(zhì)運(yùn)輸能力達(dá)到抵抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的目的。同時(shí)有研究報(bào)道，endosomal ptdlns(3) p 5-linaseFab1基因?qū)藘?nèi)體的功能具有重要的調(diào)控作用[20]。在本研究中，F(xiàn)ab1b、Fab1c和Fab1d這3個(gè)Fab1基因家族成員均在抗感染煙草品種根部顯著上調(diào)，并參與PPI網(wǎng)絡(luò)(subnetwork1，圖1)。因此，預(yù)測(cè)這些基因通過(guò)參與核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)而增強(qiáng)煙草的抗感染能力。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，抗感染煙草品種根部上調(diào)基因顯著富集在RNA介導(dǎo)的基因沉默(gene silencing by RNA)通路。RNA介導(dǎo)的基因沉默是生物體用來(lái)抵御外界核酸侵入的防御系統(tǒng)，可認(rèn)為是一種有效的免疫系統(tǒng)[21]。據(jù)研究報(bào)道，南方根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)煙草基因沉默是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默，又稱為RNA干涉(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象[22-23]?；虺聊瑫r(shí)需要由小干擾RNA (small interferencing RNA，siRNA)來(lái)進(jìn)行介導(dǎo)[24]，與一些復(fù)合物結(jié)合，降解mRNA[25]，或者結(jié)合在mRNA上作為引物[26]，從而阻斷外源基因進(jìn)行表達(dá)。此外，Dcl是參與RNA介導(dǎo)的基因沉默和siRNA形成的關(guān)鍵基因[27-32]，本研究數(shù)據(jù)顯示，Dcl基因家族成員Dcl1、Dcl2、Dcl4均在抗感染煙草品種根部顯著上調(diào)，并參與PPI網(wǎng)絡(luò)(subnetwork1，圖1)。因此，可以推測(cè)出抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草品種通過(guò)增強(qiáng)RNA介導(dǎo)的基因沉默途徑來(lái)達(dá)到抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的效果。其中Dcl2基因編碼一種類似于dicer的蛋白質(zhì)，能在被病毒感染的植物中發(fā)揮抗病毒的沉默反應(yīng)，部分拮抗Dcl2產(chǎn)生的miRNAs，當(dāng)Dcl4缺失或者受抑制時(shí)，可以作為Dcl4的替代物產(chǎn)生siRNA[33]。所以Dcl1、Dcl2、Dcl4在煙草抗南方根結(jié)線蟲(chóng)反應(yīng)中是一個(gè)共同作用體系。

3.2 結(jié)論

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，解析抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草的抗感染機(jī)制。對(duì)抗南方根結(jié)線蟲(chóng)煙草根部的差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，揭示這些基因的相互作用及其主要涉及的抗感染相關(guān)通路。初步鑒定了Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7個(gè)基因均為煙草抗感染相關(guān)的關(guān)鍵基因，本研究為進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平研究煙草根部南方根結(jié)線蟲(chóng)病的病理發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供理論指導(dǎo)。