基于不同種源的三葉青化學(xué)成分及抗氧化能力對比分析
——以浙江省杭州市富陽區(qū)為例

陳喜根，孫晗靖，楊麗君，繆強，朱羅妹，蔡曉郡*

(1.杭州市富陽區(qū)富春街道區(qū)域發(fā)展與治理中心，浙江 杭州 311402；2.杭州市富陽區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 杭州 311400；3.浙江理工大學(xué)，浙江 杭州 310018；4.杭州市富陽區(qū)場口鎮(zhèn)區(qū)域發(fā)展與治理中心，浙江 杭州 311411)

三葉青學(xué)名三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，浙江省杭州市富陽區(qū)在三葉青資源馴化選育和種植過程中，于2020—2022年對區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的5個三葉青種源集中至春江街道石硃塢基地開展農(nóng)藝性狀評價(編號為石硃1～5號)，觀察總體長勢旺盛表現(xiàn)為分枝多、密，對比區(qū)內(nèi)各種源農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定差異[1]，塊根以灰棕色—棕色為主(3號棕褐色)；莖大都圓形，近根部莖基本為明顯紫(褐)色(3號為綠色)；塊根多長橢圓形或長條形(2號為短橢圓形或顆粒狀)，直徑或粗壯程度按大小依次為1號(1.667±0.571 cm)>3號(1.388±0.433 cm)>2號(1.172±0.400 cm)>4號(0.750±0.467 cm)>5號(0.786±0.341 cm)；塊根表面大多光滑(2號有皺縮現(xiàn)象)，表現(xiàn)出不等瘤狀突起(5號無瘤狀突起)；1、2、3、5種源還表現(xiàn)出須根發(fā)達(dá)現(xiàn)象。為進一步了解區(qū)內(nèi)各種源的活性成分，以總黃酮、總多酚、多糖含量及UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力為評價指標(biāo)[2]對上述5個種源進行檢測，為富陽區(qū)內(nèi)三葉青種質(zhì)資源分類、保存、鑒定及評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗與方法

1.1 原材料處理及干燥處理方式

2020—2022年在浙江省杭州市富陽區(qū)內(nèi)開展農(nóng)藝性狀評價的5個(編號石硃1～5號)三葉青種源，栽培年份、環(huán)境均一致。取各種源新鮮三葉青塊莖，流水清洗干凈、瀝干后，分為100 g每份，置于室內(nèi)陰干，每隔3 h翻動一次，陰干150 h左右后切成1～2 mm片狀；進行真空冷凍干燥處理至恒重(含水量12%左右)。干燥后樣品用LG-01高速中藥粉碎機研磨成粉末，過60目篩(孔徑0.25 mm)，裝袋密封，置干燥密閉容器中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多糖含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取無水葡萄糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，吸取2 mL配制濃度為0.100 mg·mL-1的對照品溶液。量取對照品溶液，配置不同濃度，分別置10 mL具塞試管中，各加水補至1 mL，精密加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，再精密加硫酸5 mL，各加水補至10 mL搖勻，在490 nm處測定吸收度，以濃度C(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.436 7C+0.066(R2=0.999 3)，結(jié)果顯示，無水葡萄糖在0.02～0.12 mg·mL-1內(nèi)有良好線性關(guān)系。

樣品制備和總多糖含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉于50 mL容量瓶中，加40 mL水，沸水水浴2 h，冷卻定容至刻度，離心10 min(6 000 r·min-1)，精密取上清液5 mL，加入無水乙醇20 mL，4 ℃下靜置過夜，離心5 min，棄上清液，沉淀用80%乙醇洗滌后，離心5 min并棄上清液，重復(fù)3次，沉淀用水溶解定容至25 mL。精密量取供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，顯色處理，在490 nm處測定吸收度，計算三葉青多糖的含量。

1.2.2 總黃酮含量的測量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，加適量70%乙醇溶解，定容至200.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%AlCl3溶液0.3 mL搖勻，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min，于500 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=6.735 2C-0.010 3(R2=0.999 4)，結(jié)果顯示，蘆丁在0.01～0.09 mg·mL-1內(nèi)有良好線性關(guān)系。

樣品制備和總黃酮含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，取上清液測定總黃酮含量。取0.1 mL樣品于10 mL容量瓶中，顯色處理，于500 nm處測定吸光度，計算三葉青總黃酮的含量。

1.2.3 總多酚含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取10 mg沒食子酸，加蒸餾水溶解定容至100 mL，依次吸取該溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL福林試劑，混勻，加入5 mL飽和Na2CO3溶液定容，混勻，常溫避光放置顯色30 min，于760 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=78.419C+0.029 8(R2=0.999 3)，結(jié)果顯示，蘆丁在0.01～0.07 mg·mL-1內(nèi)有良好線性關(guān)系。

樣品制備和多酚含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，取上清液測定總多酚含量。吸取0.1 mL于10 mL容量瓶中，顯色處理，760 nm處測定吸光度值。

1.2.4 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

精密稱定樣品粉末0.1 g，加入5 mL 70%甲醇，精密稱定，超聲破碎45 min，取出，放冷，然后于10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.22 μm疏水PTFE濾頭進行過濾，即得供試品溶液，重復(fù)5次。

安捷倫BEHC18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；0.1%甲酸水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%B；1～3 min，5%～10%B；3～6 min，10%～20%B；6～16 min，20%～70%B；16～20 min，70%～100%B)；設(shè)置流量為0.3 mL·min-1，儀器柱溫30 ℃，200～600 nm為檢測波長；供試品溶液進樣量為2 μL。采用電噴霧電離；去溶劑氣體：氮氣；碰撞氣體：氬氣；全掃描：50至1 200 da，源溫度：120 ℃，去溶劑溫度：450 ℃，錐電壓：25 V，鎖定噴霧標(biāo)準(zhǔn)：400 ng·mL-1，檢測供試品，所有數(shù)據(jù)均由MassLynx4.1(Waters.MA.USA)軟件收集。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測定

精密稱取0.300 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液7.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，乙醇定容至30 mL。取樣液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管中，加乙醇補齊至1 mL，陽性對照精密稱取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到濃度為10 mg·mL-1的VC原溶液，稀釋不同濃度，加入DPPH乙醇溶液1 mL混合均勻，避光反應(yīng)90 min，517 nm下的吸光度值，記做Ai，對照以無水乙醇代替DPPH溶液，測量吸光度，記做Aj，標(biāo)準(zhǔn)組用1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合均勻，記做A0，進行3次平行實驗。按如下公式計算供試品的自由基清除率：

DPPH清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的測定

精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，乙醇定容至50 mL。取樣液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加乙醇補齊至1 mL。陽性對照精密稱取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到濃度為10 mg·mL-1的VC原溶液，稀釋不同濃度，加入ABTS溶液2 mL混合均勻，避光反應(yīng)90 min，734 nm下的吸光度值，記做Ai，對照以無水乙醇代替ABTS溶液，測量吸光度，記做Aj，標(biāo)準(zhǔn)組用1 mL ABTS溶液與1 mL乙醇混合均勻，記做A0，進行3次平行實驗。按如下公式計算供試品的自由基清除率：

ABTS清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 區(qū)內(nèi)各種源主要成分含量分析

富陽區(qū)內(nèi)各三葉青種源均含有較豐富的多糖、黃酮和總酚含量，但不同種源間成分含量差異較大(表1)，發(fā)現(xiàn)石硃1、4、5號總多糖、總黃酮、總酚類含量明顯高于石硃2、3號，由于試驗在相同環(huán)境栽培下種植取樣，可能各種源在各自生長環(huán)境溫度、光照、土壤、水質(zhì)等因素影響下，不僅外觀農(nóng)藝性狀出現(xiàn)差異，在內(nèi)含成分生成機制上亦出現(xiàn)差異，因此，在相同栽培環(huán)境條件下將對各種源具體成分差異開展進一步試驗研究。

表1 富陽區(qū)不同種源三葉青內(nèi)含主要成分含量測定Table 1 Determination of the content of main components in Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from different provenances in Fuyang District 單位：μg·g-1

通過甲醇提取開展細(xì)胞水平初步抗癌實驗得知，富陽石硃各品種1～5號IC50值為543.3、415.2、824.5、264.1、1 679 μg·mL-1，得到的石硃1～4號回歸曲線趨勢較好(石硃5號數(shù)值明顯超出其余各種源有待試驗校正)，說明區(qū)內(nèi)各三葉青種源對癌癥細(xì)胞均有一定抑制作用，但本文結(jié)果僅根據(jù)實驗數(shù)據(jù)初步分析，有待再次開展試驗以校正研究結(jié)果。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

從圖1中可以看出石硃1～5號的化學(xué)輪廓大體一致，石硃5號的成分種類表現(xiàn)更為豐富，石硃2、3號成分種類略偏少。

圖1 石硃1～5號UPLC-Q-TOF-MS/MS的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of UPLC-Q-TOF-MS/MS for Shizhu 1-5

經(jīng)過鑒定，可知只有石硃1號在保留時間為3.402時鑒定得到的化合物為vanillic acid-1-O-apiofuranosyl glucose ester，為黃酮類化合物。石硃1、4、5號保留時間為6.417時鑒定到的化合物為kaempferol-3-O-furanose-7-O-rhamnosylglucoside，為黃酮類化合物。只有石硃5號中在保留時間為7.078時鑒定得到的化合物，為isoorientin-2″-O-rhamnoside，黃酮類化合物(表2)?？芍p1～5號富含黃酮類化合物，以石硃5號中所含的黃酮類化合物最為豐富。

表2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分鑒定結(jié)果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS component identification results

2.3 DPPH及ABTS自由基清除能力對比

結(jié)果見表3，在同一濃度(1.5 mg·mL-1)下，區(qū)內(nèi)不同種源三葉青對 DPPH、ABTS自由基的清除能力大小為石硃4號>石硃5號>石硃1、2號>石硃3號。石硃4號抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余4個種源，DPPH自由基清除能力是石硃3號的3.05倍，ABTS自由基清除能力是石硃3號的4.63倍。

表3 富陽區(qū)不同種源三葉青自由基清除能力的測定結(jié)果Table 3 Measurement results of free radical scavenging ability of different provenances of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Fuyang District 單位：%

3 結(jié)論

黎穎菁等[2-8]對三葉青種質(zhì)多樣性與栽培管理研究均表明，不同產(chǎn)地、種質(zhì)三葉青塊根總黃酮含量等存在顯著差異，本試驗通過不同種源間三葉青中活性成分總黃酮、多糖、總多酚含量及DPPH、ABTS自由基清除能力對比，發(fā)現(xiàn)石硃1、4、5號總多糖、總黃酮、總酚含量明顯高于石硃2、3號；但DPPH、ABTS自由基清除能力以石硃4、5號為好。試驗基本證明了抗氧化性能與活性成分含量試驗結(jié)果相似，可能因為抗氧化性能與樣品中活性物質(zhì)含量、組成和濃度有關(guān)[9]，同時不同三葉青種源內(nèi)含成分存在差異亦表明遺傳育種上有較大的潛力。三葉青種質(zhì)遺傳多樣性解釋了其藥效成分的巨大差異[10]，作為浙江省三葉青道地產(chǎn)區(qū)的富陽要加強種質(zhì)多樣性保護，對新發(fā)現(xiàn)的小葉紫藤、易成型結(jié)塊、塊根葫蘆型三葉青種源開展種質(zhì)資源評價及株系選育馴化，進一步篩選出總黃酮等活性成分高、塊根產(chǎn)量優(yōu)、抗病性好的富陽特色種質(zhì)資源，為三葉青種質(zhì)資源分類、保存及生產(chǎn)品質(zhì)提升提供科技支撐。