蘭坪蟲草活性成分的研究進(jìn)展

張 瓊 楊玉賢 蔡 葦 董庭邦 諶立新 和順琴*

1.云南醫(yī)藥健康職業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650033；2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，云南 昆明 650033

蘭坪蟲草(Ophiocordycepslanpingensis)是中科院西雙版納熱帶植物園陳吉岳博士和楊大榮研究員近幾年在對云南蟲草屬野生資源進(jìn)行調(diào)查時(shí)，在云南省蘭坪白族普米族自治縣營盤鎮(zhèn)采集到的蟲草新種-線蟲草屬，經(jīng)分子系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為其為冬蟲夏草的近緣種[1]，將其命名為蘭坪蟲草，該區(qū)域少數(shù)民族采摘野生蘭坪蟲草食用，具有治療腎虛肝疾、預(yù)防眼病等功效。

圖1 蘭坪蟲草

經(jīng)研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，蘭坪蟲草中的活性物質(zhì)主要包括蟲草多糖、核苷類、蟲草酸、甾醇類等，其主要的化學(xué)成分種類、含量與冬蟲夏草較為接近，部分成分含量明顯高于冬蟲夏草，如人工蘭坪蟲草中的多糖含量為冬蟲夏草的1.5倍，杜亞茜[4]通過檢測發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草經(jīng)人工培養(yǎng)后核苷類成分高于野生冬蟲夏草，很有潛力成為冬蟲夏草的替代用品。大量研究數(shù)據(jù)[5-7]表明蘭坪蟲草具有多種藥理作用，能夠抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、改善肺纖維化、抗腫瘤、治療腎衰以及延緩衰老和鎮(zhèn)痛作用等，藥用和食用價(jià)值極高，具有研究和開發(fā)的潛在價(jià)值。近年來，越來越多的科研工作者對蘭坪蟲草展開了深入的研究，有關(guān)云南蘭坪蟲草的主要化學(xué)成分、含量及其藥理作用研究不斷有報(bào)道，而對于蘭坪蟲草研究成果、研究進(jìn)展方面的綜述文獻(xiàn)目前還顯見報(bào)道。據(jù)此，本文重點(diǎn)從蘭坪蟲草的主要化學(xué)成分及其藥理活性方面展開綜述，以期為云南蘭坪蟲草的深入開發(fā)、應(yīng)用及研究提供依據(jù)及奠定一些基礎(chǔ)。

1 化學(xué)成分

蘭坪蟲草的主要化學(xué)成分種類、含量與冬蟲夏草較為接近，目前已知蘭坪蟲草中含有多糖類、核苷類、總黃酮、總皂苷和總?cè)祁?、甾醇類、蟲草酸、酸脂類等成分。具體詳見表1。

表1 蘭坪蟲草主要化學(xué)成分及作用[2]

1.1 多糖類 多糖類是蘭坪蟲草中主要的活性成分之一，通過檢測人工蘭坪蟲草中的多糖含量為冬蟲夏草的1.5倍[3]。姜利[8]在研究蘭坪蟲草中性多糖減輕順鉑誘導(dǎo)的腎毒性實(shí)驗(yàn)中，用PDA培養(yǎng)基(1%～2%瓊脂粉+2%葡糖糖+2%土豆粉)、固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到蘭坪蟲草菌絲體，制得供試品蘭坪蟲草菌粉，再根據(jù)水提醇沉法從供試品中提取出蘭坪蟲草粗多糖，經(jīng)過陰離子交換色譜柱處理后，用H2O及氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液處理后待測。用凝膠滲透色譜法(GPC)測得蘭坪蟲草中性多糖(neutral polysaccharide of O. lanpingensis，ONP)的MW(平均分子量)約為6.1×104Da(道爾頓)。用FT-IR(傅里葉變換紅外光譜法)檢測后，根據(jù)FT-IR光譜圖中發(fā)現(xiàn)O-H、C-O、C=O鍵的特征吸收峰，得出蘭坪蟲草粗多糖是一種典型的碳水化合物。再用UPLC-MS對ONP中的單糖組分展開了分析，得出ONP中單糖主要由Glc(葡萄糖)、Ara(阿拉伯糖)、Man(甘露糖)、Cal(半乳糖)構(gòu)成，單糖摩爾比為27.5∶31.1∶21.9∶19.5，這些單糖是蘭坪蟲草中性多糖的主要成分。

周樹波[9]采用了與姜利相似的方法，優(yōu)化了蘭坪蟲草的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在含美洲大鐮粉的固體培養(yǎng)基上生長成熟，通過超聲破碎，高溫蒸煮，75%的乙醇沉淀，梯度洗脫(0 M-1 M NaCl)，從蘭坪蟲草菌粉中提取、分離和純化得到多糖，主要收集蘭坪蟲草多糖A組分(component A of O. lanpingensis polysaccharides，OAP)，并且對獲得的 OAP 進(jìn)行了表征，包括 GPC，F(xiàn)T-IR和高效液相色譜法(HPLC)分析單糖組成。得出OAP由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖和這五種單糖組成，其摩爾比為0.23∶0.14∶0.38∶0.05∶0.20，分子量約為1.6×104Da。

柯迎妹[10]以蒸餾水為溶劑，采用超聲、離心、水提醇沉等，從蘭坪蟲草中提取得到純的ONP，GPC法測得ONP的MW為3.2×105Da，用GC-MS(氣質(zhì)聯(lián)用法)分析ONP的單糖組分與含量(摩爾比%)，Man、Glc、Cal分別是13.38%、81.31%、5.31%，經(jīng)過FT-IR光譜圖分析后發(fā)現(xiàn)ONP是含有吡喃環(huán)和糖醛酸的酸性多糖。陳自宏[2]將蘭坪蟲草經(jīng)過潔凈處理后，通過設(shè)置對應(yīng)的溫度，干燥至恒重，為增強(qiáng)有效成分的提取，粉碎過六號篩得蘭坪蟲草供試品，并用硫酸-苯酚法、紫外分光光度計(jì)測定蘭坪蟲草樣品中多糖的含量，最終測得多糖含量為23.00±4.84 mg/g。趙聃聃等[7]通過相同的方法，測定蘭坪蟲草居群菌絲體中多糖的含量，方法準(zhǔn)確可靠。

1.2 核苷類 杜亞茜[4]通過檢測發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草經(jīng)人工培養(yǎng)后核苷類成分、含量明顯高于野生冬蟲夏草。陳自宏等[11]在研究蘭坪蟲草菌產(chǎn)腺苷的培養(yǎng)工藝中，選用樣品是野生蘭坪蟲草及其無性型蘭坪被毛孢菌，利用HPLC法測定蘭坪蟲草樣品中核苷類的含量，包括：腺苷[12](結(jié)構(gòu)如圖2所示)、2’-脫氧腺苷、腺嘌呤、尿苷(結(jié)構(gòu)如圖3所示)、尿嘧啶、肌苷、鳥苷、胸苷和胞嘧啶。做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，并對該含量測定方法進(jìn)行穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證以上含量測定方法的準(zhǔn)確性和可靠性。最終測得樣品中9種核苷類成分的含量分別是(113.11±3.70)μg/g、(9.01±0.45)μg/g、(50.63±2.70)μg/g、(2.686.83±28.72)μg/g、(71.32±3.90)μg/g、(530.59±1.75)μg/g、(636.36±29.19)μg/g、(24.55±1.63)μg/g和(3.88±1.13)μg/g，其中可通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間使腺苷的含量提高。

圖2 腺苷的結(jié)構(gòu)式

1.3 總黃酮、總皂苷和總?cè)?陳自宏等[2]用70%乙醇、乙酸乙酯溶劑從蘭坪蟲草樣品中提取總黃酮、總皂苷、總?cè)?，利用香草?冰醋酸-高氯酸顯色體系測量從樣品中提取的總皂苷和總?cè)坪?；利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系測量從樣品中提取的總黃酮含量。選擇對應(yīng)的總黃酮、總皂苷和總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)品，通過做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程；并對含量測定方法進(jìn)行穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收率的測定，驗(yàn)證以上含量測定方法的準(zhǔn)確性和可靠性。最終測得樣品中總黃酮、總皂苷和總?cè)频暮糠謩e是(10.18±0.95)mg/g、(39.61±1.75)mg/g、(53.23±1.74)mg/g。黃酮、皂苷和三萜都是從中藥材中提取出來的，在醫(yī)藥保健中是重要的天然活性成分，均具有抗氧化、抗菌抑菌、抗腫瘤等作用。

1.4 其他有機(jī)化學(xué)成分 陳自宏等[13]對蘭坪蟲草各菌株的發(fā)酵液進(jìn)行薄層色譜篩選，得到的優(yōu)良菌株用各種柱層析方法進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的分離提取，并用核磁共振氫譜、碳譜技術(shù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)。最終從蘭坪蟲草中得到蟲草素、甾醇類等，其中蟲草素備受關(guān)注。隨后陳自宏等[2]又從蘭坪蟲草中提取純化出多種化合物，有β-谷甾醇、D-甘露醇(蟲草酸)、脂肪酸、甘油酯、有機(jī)酸、烏蘇酸等，實(shí)驗(yàn)中利用紫外分光光度計(jì)、高碘酸鹽氧化法測定D-甘露醇的含量為(61.39±3.33)mg/g。其中β-谷甾醇是白色針狀結(jié)晶，分子式是C29H50O，不溶于水，具有抗腫瘤、止咳化痰等作用[14]；烏蘇酸是白色精細(xì)粉末，C30H48O3，不溶于水，屬于三萜類化合物，具有抗癌、抗病毒等作用。

1.5 無機(jī)化學(xué)元素 經(jīng)檢測[15-16]蟲草類藥物中一般含有多種無機(jī)元素，如：Pb、Cd、Se、Cr、Ca、K、P、Li、Zn、Mn、Mg、Na、Cu、Fe、Hg等30多種元素。而云南蘭坪蟲草中的無機(jī)化學(xué)元素成分及含量還尚未見報(bào)道。

2 藥理活性

2.1 對肝、肺纖維化的改善作用 柯迎妹[10]通過檢測小鼠肝臟的形態(tài)(如圖4所示)、肝指數(shù)和脾指數(shù)等，發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草多糖能夠明顯緩解小鼠肝纖維化癥狀。此外，蘭坪蟲草多糖能提高小鼠肝臟中GSH含量、SOD活力，降低小鼠血清中ALT、AST水平以及肝臟中HYP和MDA含量，表明云南蘭坪蟲草多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化確實(shí)具有較好的改善作用[17]。

蘭坪蟲草多糖可顯著減少免疫抑制小鼠脾臟組織紅髓區(qū)域充血，改善碳粒廓清能力，提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促使ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖，說明云南蘭坪蟲草多糖具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用[18-19]。

A.空白組；B.模型組；C.蘭坪蟲草多糖低劑量組；D.蘭坪蟲草多糖中劑量組；E.蘭坪蟲草多糖高劑量組圖4 蘭坪蟲草多糖對肝纖維化小鼠肝臟形態(tài)學(xué)影響示意圖[10]

江敏[20]通過研究蘭坪蟲草多糖緩解博來霉素引起的小鼠肺纖維化，表明蘭坪蟲草多糖可以改善博來霉素引起的肺纖維化。通過對肺組織重要生理生化檢測指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草多糖使肺組織形態(tài)有所改善、所測的肺系數(shù)降低，肺組織羥脯氨酸含量、病理學(xué)評分降低，明顯改善肺部氧化應(yīng)激狀態(tài)[21]。

張艷艷[22]研究發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草菌粉及其提取物對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化有一定改善作用，通過檢測對應(yīng)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化使小鼠的體重增加，SOD活性增加，MDA含量降低等；且蘭坪蟲草提取物的防治效果要明顯優(yōu)于蘭坪蟲草菌粉并具有劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及免疫反應(yīng)相關(guān)。

2.2 對腎衰竭的改善作用 急性腎功能衰竭是指各種病因引起的腎功能在短期內(nèi)(數(shù)小時(shí)或數(shù)周)急劇進(jìn)行性下降，導(dǎo)致體內(nèi)氮質(zhì)廢物潴留而出現(xiàn)的臨床綜合征。近年來，急性腎衰竭在住院患者中的發(fā)病率和死亡率逐年提高。急性腎功能衰竭目前還缺乏特異有效的治療手段，在西醫(yī)、西藥方面治療效果不佳，且具有較大的毒副作用，中醫(yī)藥在治療早、中期的慢性腎衰竭患者方面有一定的效果，基于中醫(yī)藥理論，采用中藥進(jìn)行此類疾病的防治研究具有重要意義[23]。

姜利[8]研究發(fā)現(xiàn)，從云南蘭坪蟲草中分離的中性多糖對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠有一定的改善作用，通過數(shù)據(jù)觀察得知，蘭坪蟲草中性多糖使BUN、血肌酐、鈣、MDA的含量降低，磷的含量增加，使SOD、GSH-PX的含量增加等。

蘭坪蟲草菌粉及其高、中、低劑量的水提物對腺嘌呤造成的慢性腎衰竭小鼠均有一定的改善作用。蘭坪蟲草菌粉及其不同劑量的水提物使小鼠腎臟逐漸恢復(fù)紅褐色；使血清中尿素氮、血肌酐、血磷、丙二醛的含量降低，血鈣、谷胱甘肽的含量升高，超氧化物歧化酶活力增強(qiáng)[24]。

2.3 抗衰老作用研究 顯示從蟲草中分離的多糖對果蠅有一定的延緩衰老的作用，而且效果非常明顯，抗衰老作用隨著濃度的增加而提高[25]。此外，從蘭坪被毛孢提取的粗多糖對果蠅的抗衰老作用明顯。在培養(yǎng)果蠅的過程中加入不同濃度的蘭坪被毛孢粗多糖，定時(shí)記錄果蠅的存活數(shù)、死亡數(shù)，并計(jì)算果蠅成蟲的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間。結(jié)果顯示蘭坪被毛孢提取的粗多糖使雌雄果蠅的平均壽命增加，其中粗多糖濃度為0.2%的平均壽命最高；一定濃度的粗多糖對最高壽命有影響，不同粗多糖對雌雄果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間影響差異較大，整體來看云南蘭坪蟲草粗多糖對果蠅有明顯的延緩衰老的作用[26]。

2.4 抗疲勞與增強(qiáng)免疫力作用 疲勞是長時(shí)間工作、熬夜導(dǎo)致的一種現(xiàn)象，長時(shí)間疲勞會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)病理性現(xiàn)象，所以疲勞對身體的影響很大。免疫力的高低會(huì)影響身體健康，增強(qiáng)免疫力能阻擋病毒、異物等對身體的損傷，所以免疫力對身體健康至關(guān)重要。

孔娜等[5]通過對小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，研究數(shù)據(jù)表明人工蘭坪蟲草提取物使小鼠的游泳時(shí)間增長；并測小鼠體內(nèi)檢測指標(biāo)的變化情況，發(fā)現(xiàn)人工蘭坪蟲草提取物能使二乙酰肟法測得的血尿素氮含量降低；通過測量乳酸脫氫酶的活性發(fā)現(xiàn)人工蘭坪蟲草提取物使小鼠的耐受力增強(qiáng)等；綜上指標(biāo)顯示人工蘭坪蟲草提取物對小鼠有一定的抗疲勞作用。此外，通過對小鼠脾臟組織的觀察、脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的測定、脾臟T細(xì)胞的增殖情況周期變化等，結(jié)果表明人工蘭坪蟲草提取物能增強(qiáng)小鼠的免疫力。

2.5 抗氧化作用 自由基來源于體內(nèi)一些分子的自動(dòng)氧化、酶促氧化以及藥物作用等，如果不能及時(shí)排除，自由基過量將會(huì)作用于體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪酸、細(xì)胞膜、線粒體等，導(dǎo)致機(jī)體正常細(xì)胞或組織損傷，最終引發(fā)各種疾病，如癌癥、老年癡呆、心臟病和腫瘤，通過添加自由基清除劑或者抗氧化劑可以減緩自由基給機(jī)體帶來的危害，因此天然抗氧化劑的研究十分必要。趙聃聃[7]通過對蘭坪蟲草菌絲體抗氧化活性的研究表明，蘭坪蟲草菌絲體提取的多糖、黃酮均有一定的抗氧化活性，而且抗氧化活性均隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，并且多數(shù)菌株多糖、黃酮抗氧化活性高于冬蟲夏草的抗氧化活性。

2.6 鎮(zhèn)痛作用 陳自宏等[27]通過采用小鼠醋酸扭體試驗(yàn)法，設(shè)立對照組，分別給實(shí)驗(yàn)組、對照組小鼠注射不同劑量的野生蘭坪蟲草混懸液(低劑量組、中劑量組)，蘭坪被毛孢發(fā)酵培養(yǎng)物混懸液(低劑量組、中劑量組)，蘭坪被毛孢發(fā)酵培養(yǎng)物不同提取部分(乙醇部分、乙酸乙酯部分、石油醚部分與水提部分)，觀察現(xiàn)象記錄小鼠的扭體次數(shù)，并計(jì)算鎮(zhèn)痛率，分析鎮(zhèn)痛率并與對照組對比得知，野生蘭坪蟲草和蘭坪被毛孢發(fā)酵培養(yǎng)物及蘭坪被毛孢發(fā)酵培養(yǎng)物不同提取部分均能明顯減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，說明其具有較好的鎮(zhèn)痛效果。

3 前景展望

蘭坪蟲草是近年來發(fā)現(xiàn)的蟲草新種，與冬蟲夏草同屬，親緣關(guān)系較近，其主要有效成分種類與冬蟲夏草較相似，部分成分含量明顯優(yōu)于冬蟲夏草，且易于人工培養(yǎng)，有潛力成為冬蟲夏草的替代用品[28-29]，可緩解資源匱乏導(dǎo)致的藥品短缺現(xiàn)象，具有非常重要的臨床意義。蘭坪蟲草含有蟲草多糖、核苷類、蟲草酸、甾醇類等主要活性成分，其活性成分具有對肺纖維化的改善作用、對腎衰竭改善作用、抗衰老、抗疲勞與增強(qiáng)免疫力、抗氧化、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，具有良好的開發(fā)前景。本文對云南蘭坪蟲草的化學(xué)成分、藥理活性等方面作一個(gè)較為系統(tǒng)的闡述，以期為蘭坪蟲草的深入研究奠定基礎(chǔ)。再者，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，科研工作者們對蘭坪蟲草中的主要有機(jī)活性成分、含量以及藥理作用研究較多，而對于此藥物中無機(jī)化學(xué)元素與藥理作用的關(guān)聯(lián)性分析目前還鮮見報(bào)道，可考慮對此方面內(nèi)容展開研究。