天山堇菜花舔膏提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃麗淑 吾買爾江·伊迪熱斯 阿依努爾·吾布力卡斯木 艾克熱木江·托合提蓀阿卜杜熱西提·麥麥提敏 艾力江·買買提 白克爾·麥麥提尼亞孜古再麗努爾·如則托合提 阿卜力克木·奧布力

和田地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，新疆 和田 848000

天山堇菜花舔膏出自維吾爾醫(yī)藥學(xué)古籍《卡拉巴丁卡迪日》[1]，維吾爾語中稱“羅歐克比乃非謝”，又名清肺止咳舔膏。由天山堇菜花、阿勃勒、破布木果等五味藥組成，其主要適用于降低異常膽液質(zhì)刺激性，調(diào)節(jié)血液質(zhì)，消炎，化痰，鎮(zhèn)咳。用于治療慢性支氣管炎等病癥[2]。在臨床上主要以單人單方形式制備使用，但原先制備工藝中存在制備條件模糊，無參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，制備過程完全靠制備者經(jīng)驗(yàn)，沒有現(xiàn)代化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等一系列問題。

因此，本文將以浸膏得率為主要評價(jià)指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)對天山堇菜花舔膏的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[3]。為確保制劑的安全性與有效性，本文采用薄層色譜法(TLC)[4-5]，對天山堇菜花舔膏中的天山堇菜花、阿勃勒、新疆圓棗等藥材進(jìn)行定性鑒別，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供初步的實(shí)驗(yàn)室研究資料。

1 儀器與藥材

1.1 儀器 JX5001電子天平(上海浦春計(jì)量儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科委永興儀器有限公司)；TH-Ⅱ型薄層加熱器(上?？普苌萍加邢薰?；EV342旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；VP50真空抽濾泵(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；HB-05加熱鍋(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司，規(guī)格：10 cm×10 cm，批號(hào)：20220207)；硅膠H薄層板(青島海洋化工有限公司，規(guī)格：10 cm×10 cm，批號(hào)：20210203)。

1.2 藥材 天山堇菜花(批號(hào)：H30297102，新疆麥迪森藥業(yè)有限公司)，阿勃勒(批號(hào)：M30173824，新疆麥迪森藥業(yè)有限公司)，破布木果(批號(hào)：M30138203，新疆麥迪森藥業(yè)有限公司)和綠葡萄干(批號(hào)：M30266103，新疆麥迪森藥業(yè)有限公司)，新疆圓棗(批號(hào)：KXKFZ-YP-210818，新疆新綠寶藥業(yè)有限公司)。大黃酸對照品(批號(hào)：D-202001043，中國食品藥品檢定研究院)。

2 提取方法與結(jié)果

2.1 方法 天山堇菜花、阿勃勒、新疆圓棗和綠葡萄干等藥材置圓底燒瓶，以溶媒量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為主要因素，用單因素考察法和正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳提取工藝。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝 在單因素條件的基礎(chǔ)上，為了篩選更優(yōu)選的提取條件，選取溶媒量(A)、提取時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)三個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水品，按照L9(34)正交表實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果見表2及表3。

表1 天山堇菜花舔膏提取工藝因素和水平表

表2 天山堇菜花舔膏L9(34)正交試驗(yàn)表

表3 天山堇菜花舔膏水提工藝方差分析表(P>0.05)

由直觀分析結(jié)果可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為C(提取次數(shù))>A(溶媒量)>B(提取時(shí)間)，以提取次數(shù)影響最大，提取時(shí)間的影響最小，各因素的最佳水平為A3B3C3。以提取時(shí)間為誤差項(xiàng)，對其余三因素進(jìn)行方差分析。由方差分析結(jié)果得出：A、B和C因素對提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。根據(jù)單因素與正交試驗(yàn)結(jié)果以及經(jīng)濟(jì)性綜合考慮，天山堇菜花舔膏最佳提取選擇溶媒量第一次12倍，第二次10倍，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)2次。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳提取工藝，制備3批樣品，測定浸膏得率。結(jié)果表明單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果可靠，提取后的浸膏得率相對穩(wěn)定。結(jié)果如表4所示。

表4 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 TLC鑒別方法與結(jié)果

3.1 天山堇菜花薄層色譜鑒別 取樣品50 g，用正丁醇萃取兩次，每次30 mL，取正丁醇層，合并，減壓蒸干，加20 mL無水乙醇超聲溶解，過濾，濾液蒸干，加5 mL甲醇溶解，用0.45 μL微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。按照上述方法準(zhǔn)備天山堇菜花陰性對照溶液。取天山堇菜花對照藥材(自身對照)5 g，搗碎，加20倍水，回流提取2 h，過濾，濾液蒸干，加30 mL甲醇，超聲溶解，過濾，濾液濃縮至2 mL，作為對照藥材溶液。照《中國藥典》 (2020年版)[5]薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)在統(tǒng)一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱數(shù)分鐘，置自然光和紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，無陰性干擾。結(jié)果如圖1、圖2所示。

1.天山堇菜花對照藥材；2.陰性對照；3～5.樣品 圖1 自然光下觀察圖

3.2 阿勃勒薄層色譜鑒別 取樣品50 g，用正丁醇萃取兩次，每次30 mL，取正丁醇層，合并，減壓蒸干，加20 mL無水乙醇超聲溶解，過濾，濾液蒸干，加5 mL甲醇溶解，用0.45 μL微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。按照上述方法準(zhǔn)備阿勃勒陰性對照溶液。取阿勃勒對照藥材5 g，搗碎，加5倍開水，浸泡4 h，過濾，濾液減壓蒸干，加30 mL甲醇，超聲溶解，過濾，濃縮至5 mL，作為對照藥材溶液。取大黃酸對照品配置成1 mg/mL溶液，作為對照品溶液。按照《中國藥典》 (2020年版)[5]薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取大黃酸對照品溶液和阿勃勒對照藥材溶液5 μL，陰性對照溶液和供試品溶液10 μL，點(diǎn)在分別點(diǎn)在統(tǒng)一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)和自然光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橙黃色熒光斑點(diǎn)。結(jié)果如圖3、圖4所示。

1.大黃酸對照品；2.天山堇菜對照藥材；3.陰性對照；4～6.樣品圖3 365 nm紫外燈下觀察圖

3.3 新疆圓棗的薄層鑒別 取樣品10 g，加50 mL石油醚(60～90 ℃)超聲40 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取新疆圓棗陰性對照樣品和新疆圓棗藥材，按上述方法配置成新疆圓棗陰性對照溶液和對照藥材容溶液。按照《中國藥典》 (2020年版)[5]薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液10 μL，陰性對照溶液和供試品溶液12 μL，點(diǎn)在分別點(diǎn)在統(tǒng)一硅膠H板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(12∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，無陰性干擾。結(jié)果如圖5所示。

1.新疆圓棗對照藥材；2.陰性對照；3～5.樣品圖5 365nm紫外燈下觀察圖

3.4 破布木果的薄層鑒別 取樣品50 g，用正丁醇萃取兩次，每次30 mL，取正丁醇層，合并，減壓蒸干，加20 mL無水乙醇超聲溶解，過濾，濾液蒸干，加5 mL甲醇溶解，用0.45 μL微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。取破布木果對照藥材(自身對照)5 g，搗碎，加20倍水，回流提取2 h，過濾，濾液蒸干，加30 mL甲醇，超聲溶解，過濾，濾液濃縮至2 mL，作為對照藥材溶液。照《中國藥典》 (2020年版)[5]薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)在統(tǒng)一硅膠GF254板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸-乙酸(5∶3∶0.2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同斑點(diǎn)，無陰性干擾。結(jié)果如圖6所示。

1.破布木果對照藥材；2.陰性對照；3～5.樣品圖6 254 nm紫外燈下觀察圖

4 討論

研究通過單因素考察法和正交實(shí)驗(yàn)探究了天山堇菜花舔膏的最佳提取工藝，并建立了薄層色譜鑒定方法。在單因素考察法中，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取法和不同溶媒量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對于提取率有著顯著的影響。而正交試驗(yàn)結(jié)果顯示無顯著性差異。為此，以單因素結(jié)果為準(zhǔn)，結(jié)合藥物生產(chǎn)過程中的經(jīng)濟(jì)性，確定最佳提取條件。

此外，研究還建立了薄層色譜鑒定方法，通過對天山堇菜花舔膏中的藥材進(jìn)行定性鑒別[6-9]，可以快速而準(zhǔn)確地確認(rèn)制劑中天山堇菜花、阿勃勒、新疆圓棗、破布木果等藥材的存在[10-12]，這對于天山堇菜花舔膏的質(zhì)量控制具有重要意義。

因本方采用加熱回流提取法制備，制劑中水溶性成分較多，且在舔膏劑中含大量蔗糖，從而提高了供試品的前處理難度。為了除去樣品中的蔗糖，本試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑分層法，多次沉淀、干燥、再溶等手段達(dá)到除去供試品中蔗糖等雜質(zhì)的目的。

新疆圓棗(ZiziphusjujubaMill. Var.spinosa(Bunge)Hu ex H. F.Chou)富含白樺脂酸和熊果酸，可作為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的特征性化合物[13-14]，研究過程中用白樺脂酸和熊果酸作為對照化合物，嘗試建立新疆圓棗的薄層鑒定方法，但在供試品溶液中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的斑點(diǎn)，原因可能是天山堇菜花舔膏基于水煎液濃縮制成，而白樺脂酸和熊果酸不溶于水或微溶于水[15-16]，其在供試品溶液中的量很少，不能顯現(xiàn)在薄層色譜上。因此，采用自身對照藥材來開展制劑的相關(guān)薄層研究。

研究[17-18]表明破布木果富含迷迭香酸。以迷迭香酸為標(biāo)準(zhǔn)化合物，嘗試建立天山堇菜花舔膏中破布木果藥材的薄層鑒定方法，但陰性干擾嚴(yán)重。原因可能是制劑中其它藥材也含有迷迭香酸，不能作為破布木果藥材的專屬化學(xué)成分，同樣采取藥材自身對照法來建立破布木果藥材薄層鑒別方法。

天山堇菜花舔膏在中醫(yī)(維吾爾醫(yī))長期治病過程中，廣泛用于治療各種急、慢性支氣管炎、不明原因的發(fā)熱以及各種原因?qū)е碌目人缘燃膊?。其治療效果較好，廣受患者青睞。但是，其沒有進(jìn)行過系統(tǒng)的現(xiàn)代藥學(xué)研究，缺乏工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究資料等原因沒能批量生產(chǎn)，無法滿足臨床需求量。本研究能夠滿足天山堇菜花舔膏在后期生產(chǎn)的工藝參數(shù)要求，所建立的薄層鑒定方法可以作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的一部分，能夠?yàn)樵撝苿┖笃诘脑簝?nèi)制劑研發(fā)以及新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。