UPLC-MS/MS法測定麥冬中6種植物生長調節(jié)劑殘留量

史 達 曹 玉 張 玲

南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 211100

麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f.)Ker-Gawl.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效，臨床用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥[1]，同時也是國家衛(wèi)生健康委員會公布的可用于保健食品的中藥品種之一[2]。中國是麥冬主產國，為了提高麥冬產量，種植戶常在種植過程中使用植物生長調節(jié)劑(plant growth regulators，PGRs)[3]。植物生長調節(jié)劑是一類經人工提取、合成的能調節(jié)植物的生長發(fā)育和生理功能的化學物質，主要包括矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、多效唑、烯效唑、4-硝基苯酚鈉等[4]。使用植物生長調節(jié)劑能提高麥冬的產量，但盲目、過量使用會導致麥冬中甾體皂苷、高異黃酮類等主要次生代謝產物含量顯著降低，影響藥材的有效性[5-6]。此外，部分植物生長調節(jié)劑具有一定的安全風險，如矮壯素具較高的急性毒性和刺激性[7]，丁酰肼存在潛在的致癌、致畸、致突變毒性[4]，多效唑有繁殖毒性和神經毒性[8]，長時間、高劑量的使用會導致其在麥冬中殘留，危害食用者的健康。我國制定的《食品安全國家標準——食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2021)[9]中規(guī)定了部分食品中多種植物生長調節(jié)劑的限度，但目前尚無針對藥材中植物生長調節(jié)劑殘留的限量標準。

植物生長調節(jié)劑檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)等[10]。由于色譜-質譜聯(lián)用法具有靈敏度高、專屬性強等特點，已成為麥冬中植物生長調節(jié)劑檢測的主流方法[11-13]。QuEChERS方法是一種簡單有效、安全快速、高通量的凈化方法，已被廣泛應用到農藥等多殘留的前處理當中。研究[11]發(fā)現(xiàn)QuEChERS凈化材料如C18、PSA、石墨碳等會對不同結構的植物生長調節(jié)劑產生吸附，導致丁酰肼、烯效唑等化合物回收率低于70%。本文使用的直接提取法避免了凈化材料的使用，進一步降低了檢測成本，簡化了前處理操作，可以用于麥冬中植物生長調節(jié)劑的快速篩查。本實驗通過文獻研究，并結合《食品安全國家標準—食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2021)[9]，篩選出麥冬中檢出率較高的矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、4-硝基苯酚鈉、多效唑、烯效唑等6種植物生長調節(jié)劑作為檢測指標，采用UPLC-MS/MS法進行定性定量分析，建立了麥冬中植物生長調節(jié)劑快速篩查檢測技術，并對收集到的35批麥冬進行了檢測，為指導植物生長調節(jié)劑類農藥的合理應用提供技術支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260 Infinity II-6470 LC/MS/MS高效液相-三重四極桿液質聯(lián)用系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)；XS205DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-800DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Allegra X-30離心機(貝克曼庫爾特有限公司)；Milli-Q純水儀(德國默克集團)；TM-2F渦旋振蕩器(德國WIGGENS集團)。

1.2 材料 甲酸(色譜純，德國Fluka公司)；醋酸銨(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)；試驗用水為超純水。對照品：甲哌鎓[批號：1ST24022-100M，100 μg/mL甲醇溶液，天津阿爾塔科技有限公司]；矮壯素[批號：21111XM，100 μg/mL甲醇溶液，曼哈格(上海)生物科技有限公司]；丁酰肼[批號：21609XM，100 μg/mL甲醇溶液，曼哈格(上海)生物科技有限公司]；烯效唑(批號：1ST24012-100A，100 μg/mL乙腈溶液，天津阿爾塔科技有限公司)；多效唑(批號：1ST24027-100M，100 μg/mL甲醇溶液，天津阿爾塔科技有限公司)；4-硝基苯酚鈉(批號：1ST9022-100MW，100 μg/mL甲醇∶水(9∶1)溶液，天津阿爾塔科技有限公司)。35批麥冬樣品為南京市抽驗性評價樣品，由南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院藥品所曹玉主任鑒定。

2 方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Rapid Resolution HD C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相A為0.1%甲酸的5 mmoL/L醋酸銨溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2.0 min，95% A；2.0～5.0 min，95%～25% A；5.0～9.0 min，25%～10% A；流速0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源：ESI電噴霧；掃描方式：正負離子同時掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；毛細管電壓：4000V(+)3500(-)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；優(yōu)化后的質譜采集參數(shù)見表1，各成分離子流色譜圖如圖1所示。

表1(續(xù))

1.總離子流圖(TIC)；2.甲哌鎓；3.矮壯素；4.丁酰肼；5.烯效唑；6.多效唑；7. 4-硝基苯酚鈉；A.對照品代表圖譜；B.樣品代表圖譜圖1 各成分離子流色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取粉碎后的麥冬2 g于50 mL離心管中，加入10 mL含0.1%甲酸的乙腈溶液，渦旋混勻30 s，超聲提取(功率800 W，頻率40 KHz)30 min，10000 rpm離心5 min，取上清液，殘渣加入0.1%甲酸的乙腈溶液10 mL同法再提取一次，合并上清液，用0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS分析。

2.3 標準溶液的制備 精密吸取矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、4-硝基苯酚鈉、多效唑、烯效唑各對照品溶液適量于20 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成每1 mL含矮壯素100 ng、甲哌鎓50 ng、丁酰肼5 μg、4-硝基苯酚鈉5 μg、多效唑2 μg、烯效唑2 μg的混合標準儲備液，密封，置于4 ℃保存，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 以未檢出6種植物生長調節(jié)劑的麥冬作為空白基質，按“2.2”項下方法制備麥冬基質提取溶液，稀釋混合標準溶液配制基質標準工作溶液，制成每1 mL含矮壯素0.1 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng，含甲哌鎓0.05 ng、0.1 ng、0.25 ng、0.5 ng、1 ng、2.5 ng，含丁酰肼/4-硝基苯酚鈉5 ng、10 ng、25 ng、50 ng、100 ng、250 ng，含多效唑/烯效唑2 ng、4 ng、10 ng、20 ng、40 ng、100 ng的S1～S6系列混合溶液，分別進樣。以標準溶液質量濃度為橫坐標(X)，化合物定量離子對峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸計算。實驗結果表明，6種化合物相關系數(shù)R2均大于0.99，線性關系良好。見表2。

表2 6種植物生長調節(jié)劑的線性范圍、回歸方程、檢出限和定量限

2.4.2 檢出限與定量限 以系列不同質量濃度混合標準溶液加標空白基質中，按“2.2”項下方法制備，在“2.1”項條件下進樣分析，以信噪比S/N=3質量濃度為檢出限，以信噪比S/N=10質量濃度為定量限，結果見表2?！妒称钒踩珖覙藴省称分修r藥最大殘留限量》(GB 2763—2021)[9]規(guī)定矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、4-硝基苯酚鈉、多效唑和烯效唑的最大殘留限量分別為100 μg/kg(菜籽毛油)、50 μg/kg(大豆等)、50 μg/kg(花生仁)、100 μg/kg(大豆等)、50 μg/kg(大豆等)和50 μg/kg(小麥等)，本實驗中6種植物生長調節(jié)劑的定量限均滿足要求。

2.4.3 精密度實驗 取“2.4.1”項下S2標準工作溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，測得矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、4-硝基苯酚鈉、多效唑、烯效唑峰面積RSD分別為1.1%、0.7%、0.9%、1.4%、1.7%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 回收率和重復性實驗 取麥冬空白基質2 g，精密稱定，按低、中、高濃度水平分別精密加入“2.3”項下的混合標準儲備液20 μL、100 μL、500 μL，每水平濃度平行6份，按“2.2”項下方法制備回收率和重復性樣品。6 種植物生長調節(jié)劑平均加樣回收率為80.7%～105.1%，重復性RSD為0.9%～8.1%。具體數(shù)據見表3。

表3 6種植物生長調節(jié)劑回收率和重復性實驗結果 (n=6)

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 取“2.4.4”項下加標溶液，分別在室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，在“2.1”項條件下進樣分析，結果矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、4-硝基苯酚鈉、多效唑、烯效唑峰面積的RSD分別為2.4%、1.7%、1.9%、2.1%、1.2%、1.5%，說明樣品溶液在室溫8 h內穩(wěn)定。

2.5 樣品的測定 取市售35批麥冬樣品(涉及 25 家生產企業(yè))，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣分析，結果見表4。樣品中檢出矮壯素、甲哌鎓和多效唑，其中矮壯素、多效唑的檢出率均為100%，甲哌鎓的檢出率為80%。35批麥冬中多效唑殘留量51.6～190.0 μg/kg，是《食品安全國家標準—食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2021)[9]規(guī)定的大豆等食品中最大殘留限量的1～4倍；樣品中矮壯素殘留量較低，有8批低于定量限但高于檢出限，其余27批殘留量在1.0～23.4 μg/kg范圍內，低于GB 2763-2021規(guī)定的菜籽毛油等食品中最大殘留限量100 μg/kg；5批樣品中甲哌鎓高于定量限，殘留量為0.53～0.99 μg/kg，遠低于GB 2763-2021規(guī)定的農產品中甲哌鎓的最大殘留限量50 μg/kg(大豆)；所有批次樣品均未檢出丁酰肼、4-硝基苯酚鈉和烯效唑。以上結果表明麥冬中矮壯素、多效唑等植物生產調節(jié)劑殘留檢出率較高，存在潛在安全隱患。

表4 35批樣品測定情況 (μg/kg)

3 討論

3.1 前處理方法的優(yōu)化 在提取溶劑的選擇上，乙腈對基質中的脂肪、色素等非極性成分提取較少[14]，能更好地保護色譜柱，且實驗發(fā)現(xiàn)乙腈中加入0.1%甲酸能進一步提高提取效率，因此選擇含0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。實驗比較了超聲時長對提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲時間越長，提取效率越高，至30 min時提取效率增長趨于平緩，故選擇超聲處理30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 實驗考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1，V∶V)等有機相對各植物生長調節(jié)劑響應值的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈體系下化合物的響應值更好，因此選擇乙腈為有機相。實驗發(fā)現(xiàn)水相中加入0.1%甲酸能改善拖尾現(xiàn)象，同時比較了不同醋酸銨濃度(1 mmoL/L 、2 mmoL/L、5 mmoL/L)下各化合物的響應情況，最終選擇含0.1%甲酸的5 mmoL/L醋酸銨溶液作為水相。

3.3 質譜條件的優(yōu)化 對6種植物生長調節(jié)劑分別進行了正、負離子掃描，結果顯示矮壯素、甲哌鎓、丁酰肼、多效唑、烯效唑5個化合物在正離子監(jiān)測模式下響應較好，而4-硝基苯酚鈉在負離子監(jiān)測模式下響應較好，因此采用正負離子同時掃描模式。選擇離子豐度較高的離子對作為監(jiān)測離子對，并在此基礎上優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量，最終優(yōu)化結果見表1。

3.4 基質效應的考察 基質是樣品中被分析物以外的組分，常對分析物的分析有顯著干擾，并影響分析結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應[15]?？赏ㄟ^對比基質匹配標液與相同濃度的純溶劑標液的儀器響應值來考察基質效應，二者的比值若在85%～115%，則基質效應可以忽略。本實驗對比了6種植物生產調節(jié)劑基質匹配標液與純溶劑標液的儀器響應值，發(fā)現(xiàn)丁酰肼基質增強效應超過20%，因此采用基質匹配標準曲線進行校準定量。

本實驗為麥冬中多種植物生產調節(jié)劑的快速篩查提供了一種準確靈敏的檢測方法，從35批麥冬中檢出多效唑、矮壯素和甲哌鎓殘留，其中多效唑和矮壯素的檢出率為100%，甲哌鎓的檢出率為80%，提示植物生產調節(jié)劑的使用存在一定風險，需加強引導和監(jiān)管。