藏藥阿如久巴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

謝 平 次仁旺姆 楊麗瓊 達(dá)娃卓瑪

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000

阿如久巴丸(散)系藏族驗(yàn)方，目前生產(chǎn)廠家有金哈達(dá)藏藥廠、西藏門孜康制劑中心、神猴藏藥廠等。阿如久巴丸即十味訶子丸，但為尊重傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，在藥品注冊(cè)中由訶子、藏茜草、紅花、刀豆、豆蔻、山礬葉、紫草茸、松蒂等十一味藥味加工制成丸劑水丸，呈棕灰色至棕褐色，氣芳香，味微酸、苦。具有清腎熱、止痛、利尿等作用。臨床上用于腎炎、泌尿生殖系統(tǒng)炎癥及結(jié)石引起的尿頻、尿急、尿痛、下腹部疼痛、腰膝酸痛、拖足跛行、下肢麻木等[1-2]。

本研究通過(guò)顯微鏡觀察所收集到的制劑，能夠準(zhǔn)確描述制劑粉末的顯微特征；采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別，對(duì)點(diǎn)樣量、展開劑進(jìn)行考察，確定最佳色譜條件；對(duì)檢查項(xiàng)下的水分、灰分以及酸不溶性灰分等進(jìn)行測(cè)定；并對(duì)浸出物含量進(jìn)行了測(cè)定。本研究對(duì)具有阿如久巴丸生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)的生產(chǎn)企業(yè)及制劑室進(jìn)行樣品和原料藥材的收集，依次對(duì)收集的樣品展開上述項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，研究過(guò)程中參考了《中國(guó)藥典》《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》1995年版第一冊(cè)以及十味訶子丸(阿如久巴丸)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的文獻(xiàn)報(bào)道[1，3，4]。擬定訶子、紅花和藏茜草的顯微鑒別；擬定訶子和紅花藥味的TLC鑒別。本研究對(duì)藏藥阿如久巴丸質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse E1000)；電子天平(AL104型，瑞士METTLER-TOLEDO有限公司)；紫外燈分析儀(ZF-I型，上海顧村電光儀器廠)；薄層層析硅膠板：①硅膠G板(青島海洋化工有限公司)；②硅膠G板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；③硅膠G板(青島海浪硅膠干燥劑公司)。電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱、馬弗爐、可控調(diào)溫電爐、電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試藥 本實(shí)驗(yàn)所使用的藥材來(lái)自5個(gè)廠家共5個(gè)批次的樣品，具體情況見表1。紅花對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110709-200803)；訶子對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：121015-201605)。二甲苯、中性樹膠、分析純鹽酸，超純水、甲醇、無(wú)水乙醇、碘化鉍鉀、濃硫酸等所用試劑均是國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 阿如久巴丸企業(yè)信息及樣品批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取5批阿如久巴丸樣品粉末及按處方自配阿如久巴丸粉末2g，過(guò)4號(hào)篩。將過(guò)篩后的粉末用解剖針刮出均勻涂在載玻片上，滴加稀甘油封片，蓋上蓋玻片后分別在40×、100×、400×顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖1所示。

圖1 阿如久巴丸粉末鑒定特征圖

根據(jù)以上顯微結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)敘述為：取本品，置顯微鏡下觀察石細(xì)胞類方形、類多角形或呈纖維狀，直徑14～40 μm，長(zhǎng)至130 μm，壁厚，孔溝細(xì)密(訶子)。有長(zhǎng)管分泌細(xì)胞，含黃棕色至紅棕色分泌物；花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60 μm，具3個(gè)萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起(紅花)。非腺毛基部膨大，整體呈長(zhǎng)圓錐狀；木纖維孔紋明顯；紅棕色內(nèi)含物多散在(藏茜草)。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 訶子薄層色譜鑒別[2-5]稱取阿如久巴丸樣品粉末2 g，置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。按處方中各藥味的比例，自配不含訶子的藥材粉末作為陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。取訶子對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。將上述制備的供試品，陰性對(duì)照以及對(duì)照藥材溶液用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各取10 μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，展開劑用三氯甲烷-丙酮-甲酸(7∶2∶1)，待其預(yù)飽和20 min后，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，觀察到各批次供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同藍(lán)色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰。3批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。該鑒別方法對(duì)該藥中訶子的鑒別具有很好的適應(yīng)性，分離度好，Rf值適中，重現(xiàn)性較好。結(jié)果如圖2所示。

1～5.阿如久巴丸樣品；6.訶子陰性對(duì)照；7.訶子對(duì)照藥材圖2 訶子薄層色譜鑒別圖

本研究考察了3個(gè)展開系統(tǒng)，分別為三氯甲烷-乙醇-冰乙酸(6∶1∶0.1)；三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5∶1∶0.2)；三氯甲烷-丙酮-甲酸(7∶2∶1)。結(jié)果表明三氯甲烷-丙酮-甲酸(7∶2∶1)為展開系統(tǒng)時(shí)效果最好，斑點(diǎn)清晰，無(wú)拖尾，分離度良好，故以此為展開系統(tǒng)。同時(shí)本研究對(duì)點(diǎn)樣量也進(jìn)行了考察，對(duì)照藥材溶液、供試品溶液點(diǎn)樣量考察了3 μL、5 μL、10 μL，結(jié)果表明對(duì)照藥材和供試品溶液分別為3 μL、10 μL時(shí)，斑點(diǎn)集中、清晰、不拖尾。故確定對(duì)照藥材溶液、供試品溶液點(diǎn)樣量分別為3 μL、10 μL。本研究對(duì)方法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)考察，采用不同廠家的薄層板考察：①硅膠G板(青島海洋化工有限公司)；②硅膠G板(煙臺(tái))；③硅膠G板(青島海浪硅膠干燥劑公司)，展開劑為三氯甲烷-丙酮-甲酸(7∶2∶1)，點(diǎn)樣量為供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL、3 μL，顯色劑為2%三氯化鐵乙醇溶液，于日光下檢視。

結(jié)果表明，供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。Rf值適中，分離度良好，斑點(diǎn)檢視清晰，分別采用不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板按照上述方法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果在不同條件下該方法均能將樣品良好的分離，斑點(diǎn)檢視清晰，結(jié)果表明該方法耐用性良好。

2.2.2 紅花薄層色譜鑒別[1-4]稱取阿如久巴丸樣品粉末3 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%丙酮5 mL，密塞，振搖15 min，靜置，取上清液作為供試品溶液。按處方中藥材的比例，自配不含紅花的藥材粉末作為陰性樣品，按照阿如久巴丸供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。將上述制備的供試品，陰性對(duì)照以及對(duì)照藥材溶液用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，以及對(duì)照藥材溶液各取5 μL，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)，待預(yù)飽和20 min后，展開，取出，晾干。供試品色譜中，觀察到各批次供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰。3批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。該鑒別方法對(duì)該藥中紅花的鑒別具有很好的適應(yīng)性，分離度好，Rf值適中，重現(xiàn)性較好。結(jié)果如圖3所示。

1.紅花對(duì)照藥材；2.紅花陰性對(duì)照；3～7.阿如久巴丸樣品圖3 阿如久巴丸(紅花)薄層鑒別圖(18 ℃，45%RH)

本研究考察了3個(gè)展開系統(tǒng)，并對(duì)其比例進(jìn)行調(diào)整，分別為氯仿-丙酮-冰乙酸(6∶1∶0.1)、氯仿-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.2)、乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)，結(jié)果以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開系統(tǒng)時(shí)效果最好，斑點(diǎn)清晰，無(wú)拖尾，分離度良好，故以此為展開條件。同時(shí)本研究對(duì)點(diǎn)樣量也進(jìn)行了考察，對(duì)照品溶液、供試品溶液點(diǎn)樣量考察了3 μL、5 μL、10 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照藥材溶液和供試品溶液為5 μL時(shí)，斑點(diǎn)集中、清晰、不拖尾。故確定對(duì)照藥材溶液、供試品溶液點(diǎn)樣量分別為5 μL。本研究對(duì)方法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)考察，采用不同廠家的薄層板考察：①硅膠G板(青島海洋化工有限公司)；②硅膠G板(煙臺(tái))；③硅膠G板(青島海浪硅膠干燥劑公司)，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)，點(diǎn)樣量為供試品溶液、對(duì)照品溶液各5μL，于日光下檢視。

結(jié)果表明，供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。Rf值適中，分離度良好，斑點(diǎn)檢視清晰，分別采用不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板按照上述方法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果在不同條件下該方法均能將樣品良好的分離，斑點(diǎn)檢視清晰，表明該方法耐用性良好。

2.3 阿如久巴丸水分含量、灰分及浸出物測(cè)定

2.3.1 水分測(cè)定 根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》四部通則0832水分測(cè)定項(xiàng)下[6]，選取第二法烘干法對(duì)阿如久巴丸進(jìn)行水分含量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)方法：差減法精密稱取阿如久巴丸藥材粉末3 g左右，平鋪于干燥至恒重的已編號(hào)稱量瓶中，厚度不超過(guò)5 mm，疏松阿如久巴丸藥材粉末不超過(guò)10 mm，打開瓶蓋在105 ℃下干燥5 h后將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻至室溫，精密稱定重量。再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5 mg為止。累計(jì)烘干6 h。根據(jù)公式計(jì)算阿如久巴丸樣品中含水量。

烘干法共測(cè)定5批阿如久巴丸，其中水分含量最高的批次為8.00%，最低為6.24%，平均值為6.99%。具體結(jié)果見表2。

表2 烘干法測(cè)定阿如久巴丸中水分含量結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿如久巴丸不同來(lái)源樣品應(yīng)用烘干法測(cè)定水分值相差最大在1.76%。按照2020版《中國(guó)藥典》四部通則0832水分測(cè)定法測(cè)定，5批樣品的水分均小于9.0%，符合規(guī)定。

2.3.2 灰分測(cè)定 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版第四部通則2302灰分測(cè)定法[6]，對(duì)阿如久巴丸樣品進(jìn)行總灰分及酸不溶性灰分的檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法：差減法精密稱取5 g阿如久巴丸樣品于熾灼至恒重的已編號(hào)瓷坩堝中。在電爐上加熱30 min使樣品粉末碳化，待坩堝中無(wú)白煙冒出時(shí)表明樣品粉末已碳化完全。將坩堝放入馬弗爐中550 ℃下熾灼灰化2 h后取出，冷卻至150 ℃左右放入干燥器中冷卻至室溫，稱重，再放入馬弗爐中灰化1 h，取出，稱重。重復(fù)操作2次后達(dá)到恒重，累計(jì)熾灼4 h。根據(jù)公式計(jì)算阿如久巴丸中總灰分含量。

取上項(xiàng)所得的總灰分，在坩堝中加入10% 鹽酸溶液10 mL，蓋上蓋子，置水浴上加熱10 min，坩堝蓋用5 mL熱水沖洗，洗液并入坩堝中，用快速定量濾紙過(guò)濾，坩堝內(nèi)的殘?jiān)脽崴从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，同時(shí)在另一坩堝中放入一張快速定量濾紙作為空白實(shí)驗(yàn)。坩堝及樣品105 ℃下干燥，電爐上加熱至完全碳化后，移入馬弗爐中550 ℃熾灼至恒重。根據(jù)公式計(jì)算阿如久巴丸樣品中酸不溶性灰分的含量。

空白試驗(yàn)及5批樣品結(jié)果見表3和表4，酸不溶性灰分空白試驗(yàn)結(jié)果如表3所示；阿如久巴丸的總灰分含量最高為23.10%，最低為19.87%，平均值為21.43%。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 酸不溶性灰分空白試驗(yàn)結(jié)果 (n=2)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿如久巴丸的總灰分含量與酸不溶性灰分含量差異較大。推測(cè)阿如久巴丸中堿性無(wú)機(jī)成分含量較大的原因。各樣品總灰分平均為21.43%，上浮20%為25.72%。酸不溶性灰分平均含量為0.296%，上浮20%為0.355%。對(duì)阿如久巴丸的總灰分及酸不溶性灰分的檢測(cè)是保證阿如久巴丸用藥安全的一項(xiàng)重要指標(biāo)，建議總灰分不得過(guò)26.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)0.36%，一批不合格。

表4 阿如久巴丸的總灰分及酸不溶性灰分含量 (n=3)

2.2.3 浸出物測(cè)定 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版第四部通則2201浸出物測(cè)定法[6]，測(cè)定阿如久巴丸浸出物含量。

實(shí)驗(yàn)方法：差減法精密稱取4 g阿如久巴丸樣品于250 mL錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18 h，用干燥濾器迅速濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。根據(jù)公式計(jì)算阿如久巴丸中浸出物的含量。

差減法精密稱取5份3 g上述同一批次阿如久巴丸樣品分別置于100 mL錐形瓶中，精密加水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇及95%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，再靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用所用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。根據(jù)公式計(jì)算阿如久巴丸中浸出物的含量。

取同一批次的阿如久巴丸加同一溶劑95%乙醇，分別考察了冷浸法與熱浸法，結(jié)果見表5。熱浸法所得的浸出物含量高于冷浸法所得。故進(jìn)而選擇了熱浸法對(duì)5種溶劑進(jìn)行了考察，所得結(jié)果見表6。根據(jù)表6結(jié)果，最終選定95%乙醇為浸出物提取溶劑，對(duì)5個(gè)批次進(jìn)行浸出物含量考察。結(jié)果見表7。

表5 阿如久巴丸浸出物的冷浸法與熱浸法的考察 (n=3)

表6 阿如久巴丸浸出物提取溶劑的考察 (n=3)

表7 浸出物含量 (n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明來(lái)自西藏雄巴拉曲制藥有限公司的阿如久巴丸的浸出物含量高，而來(lái)自西藏自治區(qū)藏醫(yī)院門孜康制劑室阿如巴丸浸出物含量低，推測(cè)原因可能與原藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素有關(guān)，導(dǎo)致該批次的浸出物含量低。各批次浸出物含量平均值為33.35%。下浮20%為26.68%。對(duì)阿如久巴丸的浸出物含量檢測(cè)是保證該藥用藥安全的一項(xiàng)重要指標(biāo)，建議浸出物含量不得少于27.0%，有一批浸出物含量不合格。

3 結(jié)論

本研究基于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》1995年版第一冊(cè)和中國(guó)藥典基礎(chǔ)上[3-4]，通過(guò)顯微鑒別實(shí)驗(yàn)，制定了阿如久巴丸中訶子、紅花、藏茜草顯微鑒別方法，通過(guò)薄層色譜實(shí)驗(yàn)，制定了阿如久巴丸中訶子與紅花的薄層鑒別方法，完善了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能有效幫助阿如久巴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為阿如久巴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立奠定基礎(chǔ)。