HPLC法測定蒙藥材金露梅中沒食子酸含量

郭鳳英 閆鳳杰 關(guān)金鳳 莫日根高娃 于海云

通遼市市場檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000

金露梅(PotentillafruticosaL.)又名“金老梅”“藥王茶”等，為薔薇科委陵菜屬落葉灌木，株高0.5～2 m，多分枝，羽狀復(fù)葉，花瓣黃色[1]。全株可入藥，具有清暑熱、益腦清心、健胃消食及預(yù)防心腦血管疾病等藥用功效[2]。沒食子酸為金露梅中活性成分之一[3]，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性[4-11]。目前未見對金露梅中沒食子酸含量測定的研究。本文以不同產(chǎn)地來源的金露梅為試驗藥材，建立其活性成分沒食子酸的高效液相含量測定方法，同時比較了不同產(chǎn)地的含量差異，為金露梅在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SHIMADZU LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，LabSolution 工作站)；Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；MS105DU型電子天平；DZKW-S-6數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 材料 沒食子酸對照品(批號：110831-201906，含量91.5 %，中國食品藥品檢定研究院)；水為高純水；甲醇為色譜純，鹽酸及磷酸均為優(yōu)級純。6批藥材均為自采，經(jīng)鑒定，均為金露梅(PotentillafruticosaL.)。樣品來源見表1。

表1 藥材來源表

2 方法與結(jié)果

《中華人民共和國藥典》[12]所載藥材余甘子、五倍子、委陵菜和地榆與金露梅含有相同的藥效成分——沒食子酸，故本研究以其含量測定項下的色譜條件作為參考，經(jīng)反復(fù)對比試驗，從理論塔板數(shù)，分離效果，拖尾因子及出鋒時間等方面進行考察，最終采用以下色譜條件進行試驗。

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為甲醇-0.1 %磷酸(10∶90)；流速為1.0 mL/min；檢測波長273 nm；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL；記錄時間為20 min；理論板數(shù)按沒食子酸計算，不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取沒食子酸對照品(含量91.5%)0.01252 g，置10 mL量瓶中，加50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.146 mg/mL的沒食子酸對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取金露梅供試品粉末(過四號篩)0.1 g，置250 mL錐形瓶中，精密加入4 mol/L鹽酸溶液25 mL，稱定重量，于水浴上加熱回流60 min，冷卻，稱定重量，用4 moL/L鹽酸補足減失重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項下的沒食子酸對照品儲備液30 μL、50 μL、100 μL、150 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、1200 μL，置10 mL量瓶中，用4 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得實際含沒食子酸分別為3.44 μg/mL、5.73 μg/mL、11.46 μg/mL、17.19 μg/mL、34.38 μg/mL、45.84 μg/mL、57.30 μg/mL、68.78 μg/mL、137.52 μg/mL系列濃度的對照品溶液。精密量取上述系列溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)Y，做線性回歸方程，得到Y(jié)=24561X-41022，r=1.000。表明沒食子酸在3.44～137.52 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。如圖1所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 精密度試驗 精密稱取內(nèi)蒙古阿爾山Sample-2樣品0.1013 g，按“2.2.2”項下的方法制成精密度試驗溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，重復(fù)進樣6次，測得峰面積的平均值為883641，RSD %為0.241 %，表明該方法的精密度良好。見表2。

表2 精密度測試結(jié)果表

2.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取內(nèi)蒙古阿爾山Sample-2樣品0.1016 g，按“2.2.2”項下的方法制成穩(wěn)定性試驗溶液，精密吸取10 μL，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h注入液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果顯示24 h內(nèi)峰面積RSD %為0.348 %，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果表

2.6 重復(fù)性試驗 取約0.1 g內(nèi)蒙古阿爾山Sample-2樣品6份，精密稱定，按“2.2.2”項下的方法制成重復(fù)性試驗溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。依據(jù)2.3項中的線性回歸方程計算6份樣品中沒食子酸含量，結(jié)果顯示6份樣品中沒食子酸平均含量為9.261 mg/g，含量RSD %為0.675 %，表明該方法的重復(fù)性良好。見表4。

2.7 加標(biāo)回收率試驗 取已知含量內(nèi)蒙古阿爾山Sample-2樣品(平均含量9.261 mg/g)6份，各約0.05 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，分別精密加入沒食子酸對照品儲備液0.4 ml，按2.2.2項下的方法，制成加標(biāo)回收溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。計算回收率，結(jié)果見表5，加標(biāo)回收率平均值為99.4 %，RSD %為1.588 %。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果表

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果表

2.8 不同產(chǎn)地樣品含量測定 取表1中6批產(chǎn)地藥材，按照2.2.2項下的方法，制成6批供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計算每批樣品中沒食子酸含量，結(jié)果見表6。從表中數(shù)據(jù)可以看出，6批產(chǎn)地的金露梅中，沒食子酸含量在3.156～11.537 mg/g之間，差異明顯。其中圖里河產(chǎn)地的含量約是蠻漢山產(chǎn)地的4倍。造成含量差別大的原因可能是生長環(huán)境不同，光照、土壤、水源及溫濕度等條件的差異，影響了金露梅植株的生長和代謝過程。

表6 不同產(chǎn)地金露梅中沒食子酸含量結(jié)果表

表6(續(xù))

3 討論

參照《中華人民共和國藥典》2020年版一部“余甘子、五倍子、委陵菜和地榆”等藥材含量測定項下沒食子酸的測定方法[9]，以甲醇-0.1%磷酸(10∶90)為流動相，檢測波長273 nm，此條件下沒食子酸檢測靈敏度高，其它組分對目標(biāo)峰無干擾，保留時間適宜，理論塔板數(shù)較高。

藥材粉末以4 moL/L鹽酸為提取溶劑，采用加熱回流方式提取，為保證沒食子酸提取完全，考察了回流30 min、60 min和120 min的提取含量，結(jié)果在回流60 min時含量已達到最高，故提取時間定為60 min。

含量測定結(jié)果顯示：6批產(chǎn)地金露梅中沒食子酸含量差異明顯，在3.156～11.537 mg/g之間。內(nèi)蒙古圖里河產(chǎn)地的金露梅中沒食子酸含量最高，在金露梅選購和臨床選用上可作為首選參考因素。

通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果表明該方法簡便易行，準(zhǔn)確可靠，可作為金露梅中沒食子酸含量測定的方法。