杭白菊不同溶劑提取物中總酚和總黃酮的含量及抗氧化活性比較

周玉波 馬銘研 曹 雯 嚴(yán)愛娟

浙江藥科職業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 寧波 315500

杭白菊主產(chǎn)于浙江省桐鄉(xiāng)市，是“浙八味”之一[1]，屬菊科植物菊(Chrysanthemummorifolium)的干燥頭狀花序，是2020年版《中國藥典》收載的中藥菊花中的一個(gè)重要品種[2]，菊花的功效為散風(fēng)清熱、平肝明目，具有降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等多種藥理活性[3]。杭白菊的成分十分復(fù)雜，主要含有黃酮類、酚類、多糖類、揮發(fā)油類等多種生物活性物質(zhì)，其中酚類、黃酮類是杭白菊中含量較多的有效物質(zhì)，是發(fā)揮抗氧化功能的重要成分。

化學(xué)合成的抗氧化劑因其潛在毒性和致癌作用等安全性問題在使用上受到了越來越多的限制，而來源于植物的抗氧化劑具有取材廣、高效、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，已得到越來越多的應(yīng)用[4]，開發(fā)天然抗氧化劑代替化學(xué)合成抗氧化劑具有非常重要的意義。多酚是一類廣泛存在于植物的天然抗氧化劑，植物多酚提取率主要受提取方法和溶劑的影響，可通過改變?nèi)軇?，提高多酚類的提取效率，甲醇、乙醇是極性較大的親水性有機(jī)溶劑，常常與水混合進(jìn)行提取，一定體積分?jǐn)?shù)的醇由于易破壞多酚類與多糖、蛋白質(zhì)等之間形成的氫鍵及疏水鍵，提取效果更好，在很多研究中發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為70%左右的提取率更高[5-7]。杭白菊作為藥食同源的藥材，含有豐富的多酚類，其提取物可作為天然抗氧化劑的來源加以利用，但目前關(guān)于杭白菊的研究多集中于化學(xué)成分分析和生物活性的研究，而對(duì)不同溶劑提取的多酚類含量及其抗氧化活性的研究報(bào)道較少，因此，本研究通過對(duì)杭白菊的提取，探討不同提取溶劑(70%乙醇、70%甲醇、水)對(duì)其中總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性的影響，為合理開發(fā)杭白菊提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與試藥 杭白菊(產(chǎn)地浙江)購于浙江寧波同仁堂藥店，經(jīng)鑒定為菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序。蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201811)，沒食子酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201906)，亞硝酸鈉、乙醇、甲醇、氫氧化鈉、碳酸鈉、九水硝酸鋁、福林酚試劑、濃鹽酸、乙酸鈉、冰醋酸、六水三氯化鐵均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2，2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽)、TPTZ(2，4，6-三吡啶基三嗪)、Trolox(水溶性維生素E)均購自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器 FZ102型粉粹機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；超聲波清洗機(jī)(KQ-50B，昆山超聲儀器有限公司)、METTLER XS205型分析天平(Mettler Toled公司，瑞士)；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV1600，美普達(dá)儀器有限公司)；移液器(德國艾本德)。

2 方法

2.1 杭白菊提取物的制備 杭白菊烘干，研磨后密封保存，采用以下溶劑進(jìn)行超聲方法提取。

水提取：精密稱取杭白菊粉末2.0106 g于50 mL密封玻璃瓶中，加20 mL水搖勻，浸泡20 min，再用超聲波清洗機(jī)提取 30 min(參數(shù)為40 kHz，90 W，45 ℃)，重復(fù)提取3次，濾液合并后恒溫50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL。

70%乙醇提?。壕芊Q取杭白菊粉末2.0091 g于50 mL密封玻璃瓶中，加入20 mL70%乙醇，按上述水提取步驟得到10 mL提取濃縮液。

70%甲醇提?。壕芊Q取杭白菊粉末2.0091 g于50 mL密封玻璃瓶中，加入20 mL70%甲醇，按上述水提取步驟得到10 mL提取濃縮液。

2.2 總酚含量的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用福林酚法[8]，以沒食子酸為對(duì)照品，取1 mL不同濃度沒食子酸對(duì)照品溶液(0 μg/mL、4.50 μg/mL、9.00 μg/mL、18.0 μg/mL、36.0 μg/mL、54.0 μg/mL)，分別加入0.2 moL/L福林酚試劑2.5 mL，混合均勻后避光靜置4 min，再加入10%Na2CO3溶液2.5 mL，定容至10 mL，放置45 ℃恒溫水浴中15 min，于波長為765 nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0195x+0.0238(R2=0.9998)。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密量取6份1.0 mL沒食子酸對(duì)照品溶液，加水定容到10 mL，精密移取1 mL，按照2.2.1項(xiàng)操作測定吸光度，計(jì)算RSD為1.4%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取0.3 mL杭白菊水提取液，加水定容至10 mL，再從中移取1 mL，按照2.2.1項(xiàng)操作，待溶液顯色后，每隔15 min，測定吸光度，測定6次，RSD值為0.6%，表明顯色液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次杭白菊6份，按2.1項(xiàng)方法制備水提取液，分別精密量取0.3 mL，按照2.2.1項(xiàng)操作測定吸光度，計(jì)算RSD值為2.8%(n=6)。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取6份杭白菊1.0 g，分別加入5 mg沒食子酸對(duì)照品，按2.1項(xiàng)方法制備水提取液，分別精密移取0.3mL，加水定容至10 mL，再從中移取1 mL，按照2.2.1項(xiàng)操作測定，計(jì)算加樣回收率，見表1，平均回收率為98.2%，RSD值為4.3%(n=6)。

表1 總酚加樣回收率試驗(yàn)

2.2.6 杭白菊各提取物總黃酮含量測定 將上述2.1中的提取液，各移取0.30 mL，分別用相應(yīng)的提取溶劑稀釋定容至10 mL，再從中移取1 mL，按照2.2.1項(xiàng)操作測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液的總酚含量，結(jié)果以每1克杭白菊粉末中所含沒食子酸當(dāng)量表示(mg GAE /g)。

2.3 總黃酮含量的測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，參照文獻(xiàn)[9]，以蘆丁作為對(duì)照品，分別精密移取蘆丁對(duì)照品溶液(0.110 mg/mL)0.0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，各加入0.3 mL的5% NaNO2溶液，混勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 的10% Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜置15 min后，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.028x-0.0005(R2=0.9995)。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取6份1.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液，按照2.3.1項(xiàng)操作測定吸光度，計(jì)算RSD為1.1%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取0.1 mL杭白菊水提取液，按照2.3.1項(xiàng)操作，待溶液顯色后，每隔15 min，測定吸光度，測定6次，RSD值為1.3%，表明顯色液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次杭白菊6份，按2.1項(xiàng)方法制備水提取液，分別精密量取0.1 mL，按照2.3.1項(xiàng)操作測定吸光度，計(jì)算RSD值為2.9%(n=6)。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取6份杭白菊1.0 g，分別加入10 mg蘆丁對(duì)照品，按2.1項(xiàng)方法制備水提取液，分別精密移取0.1 mL，按照2.3.1項(xiàng)操作測定，計(jì)算加樣回收率，見表2，平均回收率為103.1%，RSD值為4.4%(n=6)。

表2 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)

2.3.6 杭白菊各提取物總黃酮含量測定 將上述2.1中的提取液，各移取0.10 mL，按照2.3.1項(xiàng)操作測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液的總黃酮含量，結(jié)果以每1 g杭白菊粉末中所含蘆丁當(dāng)量表示(mg RE/g)。

2.4 DPPH自由基清除能力 參照文獻(xiàn)[10]，精密移取2.1項(xiàng)下提取液各40 μL，補(bǔ)甲醇至200 μL，分別加入0.132 mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液 7 mL，混勻后避光靜置30 min，以甲醇做空白，517 nm下測定吸光度，同時(shí)測定不加提取液的空白試劑的吸光度，計(jì)算差值。將Trolox(水溶性維生素E)作對(duì)照品，以其濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值A(chǔ)(AB-AS，其中AB為未添加Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的樣品吸光度，AS為添加不同體積Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的樣品吸光度)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.5505x+0.0002(R2=0.9954)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液的DPPH自由基清除能力，結(jié)果以每1克杭白菊粉末中的Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g)。

2.5 ABTS自由基清除能力 將7.4 mmoL/L ABTS溶液與2.6 mmol/L的K2S2O8溶液等量混合后，避光反應(yīng)16 h，取其中2.55 mL甲醇稀釋至100 mL，在734 nm波長處測定吸收度為0.955，即得ABTS自由基工作液。

參照文獻(xiàn)[11]，精密移取2.1項(xiàng)下提取液各5 μL，補(bǔ)甲醇至100 μL，分別加入5.00 mL ABTS工作液，渦旋混勻后置避光處30 min，以甲醇做空白，在734 nm處測吸光值，同時(shí)測定不加提取液的空白試劑的吸光度，計(jì)算差值。將Trolox(水溶性維生素E)作對(duì)照品，以其濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值A(chǔ)(AB-AS，其中AB為未添加Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的樣品吸光度，AS為添加不同體積Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的樣品吸光度)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.5695x-0.0392(R2=0.9986)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液的ABTS自由基清除能力，結(jié)果以每1 g杭白菊粉末中的Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g)。

2.6 FRAP(鐵離子還原能力) 將10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmoL/L FeCl3·6H2O和0.3 mol/L的醋酸緩沖液(pH3.6)按1∶1∶10的體積比混合均勻，37 ℃預(yù)熱30 min，即得FRAP工作液。

參照文獻(xiàn)[12]，精密移取2.1項(xiàng)下提取液各5 μL，補(bǔ)甲醇至150 μL，分別加入2.85 mL FRAP工作液，渦旋混勻后顯紫色，置避光處30 min，以試劑空白作參比，于593 nm處測定吸光度。將Trolox作對(duì)照品，以其濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.7664x+0.0517 (R2=0.9981)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液的鐵離子還原能力，結(jié)果以每1 g杭白菊粉末中的Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g)。

2.7 數(shù)據(jù)分析 所有重復(fù)測量的數(shù)據(jù)均以“平均加減標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，應(yīng)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Least Significant Difference (LSD)和Student-Newman-Keuls (S-N-K)檢驗(yàn)來進(jìn)行差異顯著性分析，用Pearson相關(guān)系數(shù)來衡量相關(guān)性，P<0.05表示顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 總酚和總黃酮的含量 杭白菊經(jīng)不同溶劑超聲提取后，其總酚含量和總黃酮含量見表3。

表3 杭白菊不同溶劑提取物中總酚含量和總黃酮含量

三種提取物之間總酚、總黃酮含量均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，其中70%乙醇作為提取溶劑提取的總酚、總黃酮含量均為最高，分別為(6.66±0.52)mg GAE/g和(15.64±0.56)mg RE/g，70%甲醇次之，而水作為溶劑提取效率是最低的，這與酚類物質(zhì)在不同溶劑中的溶解度不同有關(guān)[13]，說明對(duì)于提取杭白菊中的多酚類物質(zhì)，70%乙醇作為溶劑其提取效率是三者中最高的。

3.2 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基加入自由基清除劑時(shí)，在最大吸收波長處的吸收度變小，變小程度與自由基清除能力相關(guān)，因此，被廣泛用于衡量各種天然產(chǎn)物的自由基清除能力[10]。由表4可知，杭白菊三種提取物都具有一定的DPPH自由基清除能力，大小順序依次為：70%乙醇提取物 > 70%甲醇提取物 >水提取物，70%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除能力是最強(qiáng)的，水提取物是最弱的，但與70%甲醇提取物的DPPH自由基清除能力接近，三種提取物的DPPH自由基清除能力不存在顯著性差異(P>0.05)。

表4 杭白菊不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力測定結(jié)果

3.3 ABTS自由基清除能力 ABTS呈藍(lán)綠色，加入抗氧化物質(zhì)后，發(fā)生褪色，顏色越淺，在最大吸收波長處的吸收度變得越小，說明該抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力越強(qiáng)[11]。表4中，杭白菊三種提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力由高到低依次為：70%乙醇提取物 > 70%甲醇提取物 >水提取物，并存在顯著性差異(P<0.05)。三種提取物中，70%乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除效果明顯是最好的，而水提取效果最差。

3.4 FRAP鐵離子還原能力 FRAP法作為一種簡單有效的方法常用于測定植物提取物中抗氧化成分的還原鐵離子的能力[12]。表4顯示，杭白菊三種提取物對(duì)鐵離子還原能力大小順序和以上兩種測定方法一致，其中，70%乙醇提取物的鐵離子還原能力雖然大于70%甲醇提取物，但無顯著性差異(P>0.05)，而水提物明顯是最弱的(P<0.05)。以上三種抗氧化能力測定結(jié)果也進(jìn)一步說明70%乙醇是提取杭白菊抗氧化活性物質(zhì)較好的溶劑。

3.5 相關(guān)性分析 對(duì)杭白菊不同溶劑提取物中總酚、總黃酮含量和抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析(見表5)。

表5 杭白菊中總酚含量、總黃酮含量和抗氧化活性的相關(guān)性分析

其中總酚和總黃酮含量與ABTS自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)也很高，說明杭白菊中多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)對(duì)其表現(xiàn)出的ABTS自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力起著重要的作用，但總酚和總黃酮的含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)性卻不高，可能杭白菊提取物抗氧化能力的強(qiáng)弱還與其中物質(zhì)的種類和組成有關(guān)[14]。

4 結(jié)論

本研究測定了杭白菊不同溶劑超聲提取物中總酚和總黃酮的含量，結(jié)果顯示，三種提取物中總酚、總黃酮的含量大小順序?yàn)椋?0%乙醇提取物 > 70%甲醇提取物 >水提取物，70%乙醇作為提取溶劑提取的總酚和總黃酮含量均為最高，說明在同樣的超聲波提取條件下，三種溶劑中70%乙醇是提取杭白菊酚類、黃酮類物質(zhì)效率最高的溶劑。

本研究采用了三種方法(DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力)對(duì)杭白菊提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)各提取物呈現(xiàn)不同程度的抗氧化活性，70%乙醇提取物的活性最強(qiáng)，其中總酚和總黃酮含量與ABTS自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，本研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)利用杭白菊提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。此外，提取物的抗氧化活性不能只關(guān)注其總酚、總黃酮含量，還應(yīng)考慮提取物中主要物質(zhì)的化學(xué)組成、含量和化學(xué)結(jié)構(gòu)，這也是影響抗氧化活性的重要因素，因此也需要進(jìn)一步對(duì)提取物中單個(gè)酚類、黃酮類化合物進(jìn)行分析和鑒定，以便更好地研究它們的抗氧化作用機(jī)制。