南鶴虱水提物及乙醇提取物對小鼠皮膚刺激性的初步研究

趙思燁 葉明星 陳山珊 丘志龍 茍文韜 顏偉泓 張偉云，2*

1.廈門醫(yī)學院藥學系/廈門市中藥生物工程重點實驗室，福建 廈門 361023；2.福建醫(yī)科大學藥學院，福建 福州 350122

南鶴虱又稱竊衣子、野蘿卜子，是傘形科植物野胡蘿卜(DaucuscarotaL.)的干燥成熟果實，在我國主要分布于江蘇、湖北、陜西、河南等省[1]。南鶴虱性平，味苦，微毒性；其歸脾、胃經(jīng)；具有殺蟲消積功效[2]，用于蛔蟲、蟯蟲、絳蟲病等體內(nèi)蟲積病癥的治療[3]。《新修本草》中記載該藥“主蛔、曉蟲，為散”；《開寶本草》中記載該藥 “蟲心痛，以淡醋和半匕服”，功效皆為殺蟲[4]。

南鶴虱的化學成分主要有揮發(fā)油、萜類、黃酮、甾體類等[5-9]。研究[10]表明，南鶴虱的揮發(fā)性成分對蚊幼蟲具有很好的殺滅作用；南鶴虱的甲醇提取物、戊烷提取物有一定的抑菌、抗腫瘤作用[11-12]；南鶴虱中還存在具有改善認知功能障礙[13]、修復肝臟損傷[14]等作用的成分。目前已有學者嘗試將南鶴虱用于治療皮膚病[15]，且在現(xiàn)代研究中乙醇和水為最常用的提取溶劑[16]，水是強極性溶劑，南鶴虱中的親水性成分都能被水溶出，乙醇是最常用的親水性有機溶劑，乙醇的溶解范圍廣，故本實驗采用水、乙醇分別對南鶴虱進行提取，為進一步驗證其皮膚用藥的安全性，故開展皮膚刺激性實驗，皮膚刺激性實驗能夠反映受試物對皮膚是否存在刺激性，可用于初步評價受試物作用于皮膚的安全性。

實驗以南鶴虱的水提物和乙醇提取物作為研究對象，分別對小鼠正常皮膚及劃傷皮膚涂抹給藥，通過觀察小鼠的皮膚情況和計算皮膚刺激積分的平均分值，從而評價南鶴虱皮膚用藥的安全性，為后續(xù)進一步研發(fā)南鶴虱的護膚產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材 實驗所用南鶴虱采自中國河南省，由廈門醫(yī)學院藥學系中藥學專業(yè)的向云亞老師鑒定其為傘形科植物野胡蘿卜(DaucuscarotaL.)的干熟成熟果實。

1.2 實驗動物 健康SPF級ICR小鼠36只,雌雄各半,體重20～25 g,浙江省實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0002,合格證編號:20210506Abzz0100000542(雌)、20210506Abzz0100000316(雄)。

1.3 儀器 脫毛膏(廣州諾菲化妝品有限公司)、EYEL4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器公司)。

2 實驗方法

2.1 提取物的制備

2.1.1 南鶴虱水提物的制備 取河南產(chǎn)南鶴虱藥材500 g，分為5份，每份分別與1000 mL的蒸餾水共同加入2000 mL圓底燒瓶中，浸泡1 h，電熱套設(shè)定溫度為150 ℃，將藥材加熱煎煮至沸騰，共煎3次，每次1 h，停止加熱，將3次濾液合并。重復上述實驗操作4次，合并濾液，濃縮，得到南鶴虱水提物(3.3 g生藥/mL)，置于4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 南鶴虱乙醇提取物的制備 取河南產(chǎn)南鶴虱藥材500 g，分為5份，每份分別與1000 mL的75%乙醇溶液共同加入2000 mL圓底燒瓶中，電熱套設(shè)定溫度為85 ℃，回流提取3次，每次1 h，將三次濾液合并，重復上述實驗操作4次，合并濾液，濃縮，得到南鶴虱乙醇提取物(3 g生藥/mL)，置于4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 一次給藥皮膚刺激性實驗 取SPF級ICR小鼠18只，雌雄各半，隨機分為3組：空白對照組、一次給藥水提物組和一次給藥醇提物組，每組6只。隨機分組后，使用脫毛膏去除小鼠背部脊柱兩側(cè)的毛發(fā)，脫毛范圍為2 cm×3 cm，將小鼠右側(cè)皮膚劃傷為 “=”字形，以皮膚滲血為度[17]，分為左側(cè)的正常皮膚區(qū)與右側(cè)的劃傷皮膚區(qū)?？瞻讓φ战M兩側(cè)皮膚均涂純水，水提物組、醇提物組于皮膚兩側(cè)分別涂抹南鶴虱水提物、乙醇提取物，涂抹面積均為2 cm×3 cm。給藥后用紗布覆蓋兩側(cè)的脫毛區(qū)域并用無刺激的醫(yī)用膠布進行固定，24 h后拆除[18]，用蒸餾水清洗凈小鼠兩側(cè)皮膚，在清洗后的1 h、24 h、48 h、72 h時刻分別觀察涂抹部位是否出現(xiàn)紅斑、水腫等現(xiàn)象，按皮膚刺激反應(yīng)積分以及皮膚刺激強度評分標準進行評價。

2.3 連續(xù)多次給藥皮膚刺激性實驗 實驗方法與一次給藥皮膚刺激性實驗相同，空白對照組每日于皮膚兩側(cè)涂抹純水1次，涂抹面積為2 cm×3 cm，連續(xù)涂抹7 d；水提物組、醇提物組每日于皮膚兩側(cè)分別涂抹南鶴虱水提物、乙醇提取物1次，涂抹面積為2 cm×3 cm，連續(xù)涂抹、觀察7 d；7 d后三組小鼠用蒸餾水擦洗凈兩側(cè)皮膚后再觀察7 d。每次在相同的時間內(nèi)觀察，連續(xù)觀察14 d，按皮膚刺激反應(yīng)積分以及皮膚刺激強度評分標準進行評價。

2.4 皮膚刺激評價標準 皮膚刺激反應(yīng)的表現(xiàn)主要是觀察皮膚是否有紅斑，水腫的現(xiàn)象[19]。參考國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中華人民共和國國家標準化妝品安全性評價程序和方法》對皮膚紅斑、水腫的現(xiàn)象進行分類，每一類對應(yīng)一種積分[20]，見表1。皮膚刺激強度的評價：每只動物的平均分值=(紅斑總分+水腫總分)/ 動物數(shù)量，得出的分值即為相應(yīng)的皮膚刺激強度[20]，見表2。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評分標準[20]

表2 皮膚刺激強度評分標準[20]

3 結(jié)果

3.1 一次給藥皮膚刺激性實驗 一次給藥后，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)各組小鼠行為、活動均無異常，無死亡現(xiàn)象?？瞻讓φ战M小鼠在各時刻兩側(cè)皮膚均正常，無紅斑、水腫現(xiàn)象。一次給藥水提物組中，在1 h時刻有小鼠左側(cè)皮膚出現(xiàn)中度紅斑，右側(cè)皮膚出現(xiàn)中度水腫現(xiàn)象，在24 h、48 h、72 h時刻皮膚紅斑、水腫現(xiàn)象逐漸消退，其余小鼠各時刻兩側(cè)皮膚均無紅斑、水腫現(xiàn)象。一次給藥醇提物組中，在24 h時刻有小鼠右側(cè)皮膚出現(xiàn)輕度紅斑現(xiàn)象，在48 h、72 h時刻皮膚紅斑現(xiàn)象逐漸消退，其余小鼠各時刻兩側(cè)皮膚均無紅斑、水腫現(xiàn)象。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比較，南鶴虱水提物組、醇提物組兩側(cè)皮膚的皮膚反應(yīng)積分均無顯著性差異。各組皮膚反應(yīng)積分值見表3，皮膚刺激強度評價見表4，小鼠皮膚反應(yīng)代表性照片如圖1。

表3 一次給藥對小鼠皮膚刺激反應(yīng)分值 (n=6)

表4 一次給藥對小鼠皮膚刺激強度評分 (n=6)

圖1 小鼠皮膚反應(yīng)代表性照片

3.2 連續(xù)多次給藥皮膚刺激性實驗 多次給藥后，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)各組小鼠行為、活動均無異常，無死亡現(xiàn)象?？瞻讓φ战M、多次給藥水提物組及醇提物組小鼠兩側(cè)皮膚均正常，無紅斑、水腫現(xiàn)象。各組小鼠的皮膚反應(yīng)刺激強度得分均為0分，表明在連續(xù)多次給藥實驗中，南鶴虱的水提物及乙醇提取物對小鼠的正常皮膚和劃傷皮膚均無刺激性。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比較，南鶴虱水提物組、醇提物組兩側(cè)皮膚的皮膚反應(yīng)積分均無顯著性差異。

4 討論

皮膚刺激性實驗是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性損傷，包括一次給藥皮膚刺激性實驗和多次給藥皮膚刺激性實驗[20]，其典型表現(xiàn)是出現(xiàn)紅斑或水腫現(xiàn)象。一次給藥皮膚刺激性實驗能夠直接反映受試物對皮膚的刺激程度，多次給藥皮膚刺激性實驗則能夠反映受試物對皮膚的刺激性以及受試物對皮膚長期的慢性積累刺激性[21]。

本實驗參考國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中華人民共和國國家標準化妝品安全性評價程序和方法》，對南鶴虱的水提物及乙醇提取物作用皮膚的安全性進行研究。實驗結(jié)果表明，一次給藥皮膚刺激性實驗中，南鶴虱水提物組、醇提物組各有1只小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫現(xiàn)象，其余小鼠皮膚均正常，按照皮膚刺激評價標準計算，小鼠的皮膚反應(yīng)刺激強度得分均小于0.5分，以表4評價皮膚刺激強度，表明南鶴虱的水提物及乙醇提取物對小鼠正常皮膚和劃傷皮膚均無明顯刺激性。在連續(xù)多次給藥皮膚刺激性實驗中，各組小鼠均沒有產(chǎn)生明顯的刺激反應(yīng)，小鼠皮膚均無紅斑、水腫現(xiàn)象，小鼠正常皮膚及劃傷皮膚的皮膚反應(yīng)平均積分值均為0分，表明南鶴虱的水提物及乙醇提取物對小鼠正常皮膚和劃傷皮膚均無刺激性。

綜上所述，南鶴虱的水提物及乙醇提取物對正常皮膚和劃傷皮膚的刺激性小，為前期課題組開展南鶴虱提取物驅(qū)蚊、護膚的相關(guān)研究提供了實驗參考，也為探討南鶴虱更廣泛的用途提供一定的理論依據(jù)。但本實驗僅在一種實驗動物上進行研究，實驗結(jié)果具有局限性，仍需在多種實驗動物上進行研究相互驗證，以獲取更加準確的結(jié)果。