潰結(jié)康調(diào)控PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究

李小絲 馬建國(guó) 徐榮漪 祁 燕*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650000；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科，云南 昆明 650021

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床中常見(jiàn)的非特異性腸道炎癥性疾病，極易復(fù)發(fā)及癌變。近年來(lái)，UC 的發(fā)病率逐年増高[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎患者具有更高的結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)生率，且風(fēng)險(xiǎn)隨年齡的增長(zhǎng)而增加。UC發(fā)病率的逐年上升和治療潰瘍性結(jié)腸炎的諸多問(wèn)題使得加強(qiáng)其病因和發(fā)病機(jī)理的研究，尋求切實(shí)有效、副作用小的治療手段成為世界性的難題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是各種原因引起的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集導(dǎo)致的穩(wěn)態(tài)失衡。在真核細(xì)胞中，ERS可通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)正確折疊及分泌，暫停早期蛋白質(zhì)的翻譯合成，以利于細(xì)胞生理功能的恢復(fù)[3]。過(guò)度和延長(zhǎng)的ERS反應(yīng)會(huì)通過(guò)涉及依賴或不依賴線粒體的凋亡通路最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。腸道黏膜上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)具有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到體內(nèi)、外因素破壞時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到影響，即可觸發(fā)ERS、UPR及其介導(dǎo)的信號(hào)通路，進(jìn)而激發(fā)促炎因子級(jí)聯(lián)釋放、細(xì)胞凋亡途徑及腸黏膜屏障障礙等病理變化，使腸黏膜受損，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生發(fā)展。

潰結(jié)康為云南省中醫(yī)醫(yī)院王華寧主任醫(yī)師臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎經(jīng)驗(yàn)方，全方由痛瀉要方化裁而來(lái)，具有疏肝健脾、清熱涼血止血之功。目前，課題組已明確其物質(zhì)基礎(chǔ)，并從調(diào)控NLRP3炎性體、氧化應(yīng)激、自噬、腸道菌群等不同環(huán)節(jié)對(duì)該方的作用機(jī)制進(jìn)行了探討[5-8]。

鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而破壞腸道上皮屏障功能，潰結(jié)康對(duì)UC病變時(shí)腸黏膜損傷具有明顯促進(jìn)作用，本研究從調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度探討該方作用機(jī)制，以進(jìn)一步豐富疏肝健脾方治療UC的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 C57BL/6雌性小鼠50只，體重18～22 g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，質(zhì)量檢測(cè)單位：蘇州西山生物技術(shù)有限公司，小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，12 h明暗交替，自由攝取滅菌飼料和飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和藥物 潰結(jié)康處方藥材飲片白術(shù)、云茯苓、白芍、陳皮、防風(fēng)等，購(gòu)自云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，藥材加入10 倍體積水，煎煮3次后，合并水煎液，過(guò)濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮制備流浸膏凍存于-20 ℃冰箱備用。柳氮磺胺吡啶腸溶片，國(guó)藥準(zhǔn)字 H31020557，上海新信誼天平藥業(yè)有限公司。葡聚糖硫酸鈉(DSS)，購(gòu)自MP公司，貨號(hào)：M8667；elF2 alpha(貨號(hào)：AF6087)、Phospho-elF2 apha(貨號(hào)：AF3087)、Phospho-PERK(貨號(hào)：AF4499)、PERK Antibody(貨號(hào)：AF4799)，以上抗體均購(gòu)自Affinity；ATF4 Polyclonal antibody(貨號(hào)：28657-AP)、CHOP GADD153 Polyclonal antibody(貨號(hào)：15204-AP)，GRP78/BIP Polyclonal antibody(貨號(hào)：11587-AP)，以上抗體均購(gòu)自proteintech。

1.3 儀器 RM2235切片機(jī)、ASP300S脫水機(jī)、DM2500正置顯微鏡+圖文系統(tǒng)(德國(guó) Leica)，BIORAD電泳儀、電泳槽，Odyssey CLX紅外熒光掃描成像系統(tǒng)。

1.4 分組、造模及給藥 50只C57BL/6雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為：空白組、模型組，KJK 12.8 g/kg組、KJK 6.4 g/kg組、柳氮磺胺吡啶組(0.45g/kg)，每組10只。除空白組外，其余4組參考 Wirtz等[9]的方法建立急性UC小鼠模型，造模同時(shí)給予蒸餾水或?qū)?yīng)藥物灌胃治療，連續(xù)7d后脫頸椎處死，分離結(jié)腸，測(cè)定結(jié)腸長(zhǎng)度后，選取1 cm中段結(jié)腸組織以磷酸鹽緩沖液沖洗，置于4%多聚甲醛中固定，剩余組織置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 每天觀察動(dòng)物體質(zhì)量、大便性狀和隱血情況，按照表1進(jìn)行評(píng)分，將各項(xiàng)評(píng)分相加，得出每只動(dòng)物的DAI，以評(píng)估疾病活動(dòng)情況。DAI評(píng)分=(體質(zhì)量下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+大便隱血情況評(píng)分)/3。見(jiàn)表1。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取置于4%多聚甲醛中固定的結(jié)腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片染色后顯微鏡下觀察結(jié)腸病理變化，對(duì)各組小鼠進(jìn)行Geboes評(píng)分[10]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：組織發(fā)生結(jié)構(gòu)改變計(jì)0分，發(fā)生慢性炎癥計(jì)1分，固有層可見(jiàn)中性粒細(xì)胞計(jì)2分，上皮層可見(jiàn)中性粒細(xì)胞計(jì)3分，隱窩結(jié)構(gòu)破壞計(jì)4分，發(fā)生糜爛或潰瘍計(jì)5分。

1.5.3 Western blot方法檢測(cè) UC小鼠結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK、p-elF2α蛋白表達(dá) 結(jié)腸組織加入蛋白裂解液及蛋白酶、磷酸酶抑制劑，勻漿完成離心收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)變性后上樣并電泳、濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜兩次后孵育一抗并4 ℃過(guò)夜，次日，TBST洗膜后，轉(zhuǎn)移到含有二抗(稀釋比例為1∶5000)的孵育盒中1 h，孵育完成后，TBST洗膜四次，紅外熒光成像掃描系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，用Image J軟件對(duì)每條條帶進(jìn)行讀取分析，以目的蛋白與β-actin的密度比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 潰結(jié)康對(duì)UC模型小鼠體重、疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分和結(jié)腸長(zhǎng)度的影響 與空白組比較，模型組小鼠體重第3天開(kāi)始下降(P<0.01))；第5天、第7天顯著下降(P<0.001)，DAI評(píng)分明顯升高(P<0.001)，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg、6.4 g/kg組小鼠體重第5天、第7天結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加(P<0.05)、DAI評(píng)分明顯降低(P<0.05)；柳氮磺胺吡啶組小鼠體重第3天、第5天、第7天明顯增加(P<0.01、P<0.05)，DAI評(píng)分顯著降低(P<0.05)，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體重、DAI評(píng)分表和結(jié)腸長(zhǎng)度

2.2 潰結(jié)康對(duì)UC模型小鼠結(jié)腸組織形態(tài)及Geboes評(píng)分的影響 HE染色結(jié)果表明，空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠結(jié)腸組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞破壞，黏膜下層充血水腫。KJK組小鼠腺體結(jié)構(gòu)完整度好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度及結(jié)腸黏膜破壞減輕。如圖1所示。Geboes評(píng)分結(jié)果表明，與空白組比較，模型組Geboes評(píng)分顯著升高(P<0.001)；KJK 12.8 g/kg、6.4 g/kg組和柳氮磺胺吡啶組Geboes評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 潰結(jié)康對(duì)UC小鼠Geboes評(píng)分的影響

2.3 潰結(jié)康對(duì)UC模型小鼠結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α /elF2α蛋白的影響

2.3.1 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白GRP78、CHOP的影響 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg組可顯著下調(diào)GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.01、P<0.05)；KJK 6.4 g/kg組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；柳氮磺胺吡啶組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.01、P<0.05)。見(jiàn)表4，如圖2所示。

表4 潰結(jié)康對(duì)UC小鼠結(jié)腸GRP78、CHOP蛋白表達(dá)的影響

A.空白組；B.模型組；C.KJK 12.8 g/kg組；D.KJK 6.4 g/kg組；E.柳氮磺胺吡啶組圖2 潰結(jié)康對(duì)UC小鼠結(jié)腸中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)的影響圖

2.3.2 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控蛋白ATF4、p-PERK、p-elF2α表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg組ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；KJK 6.4 g/kg組ATF4、p-PERK/PERK蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，p-elF2α/elF2α蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；柳氮磺胺吡啶組ATF4、p-elF2α /elF2α蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，p-PERK/PERK蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表5，如圖3所示。

表5 潰結(jié)康對(duì)UC小鼠結(jié)腸ATF4、p-PERK/PERK、p-elf2α /elf2α 蛋白表達(dá)的影響

A.空白組；B.模型組；C.KJK 12.8 g/kg組；D.KJK 6.4 g/kg組；E.柳氮磺胺吡啶組圖3 潰結(jié)康對(duì)UC小鼠結(jié)腸ATF4、GRP78、p-PERK等蛋白表達(dá)的影響圖

3 討論

研究[11]表明，腸上皮細(xì)胞凋亡、腸黏膜損傷導(dǎo)致腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)破壞是UC發(fā)病和復(fù)發(fā)的重要原因。目前，國(guó)際上已將“黏膜愈合”確定為UC的主要治療目標(biāo)和重要預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。促進(jìn)腸上皮黏膜修復(fù)，維持腸屏障功能穩(wěn)態(tài)已成為治療UC藥物研發(fā)的主要方向。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為鈣離子代謝、蛋白質(zhì)發(fā)揮功能及脂質(zhì)合成的主要場(chǎng)所。在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞受到多種外源性應(yīng)激源刺激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量未折疊或以錯(cuò)誤方式折疊的蛋白質(zhì)積聚或腔內(nèi)鈣離子失衡誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡過(guò)程[12]。正常狀態(tài)下，ERS標(biāo)志蛋白-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated pro- tein78，GRP78)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白PERK、活化轉(zhuǎn)錄因子 6(activating transcription factor 6，ATF6)和肌醇酶 1(inositol requiring enzyme l，IREI)結(jié)合，疾病狀態(tài)下，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，GRP78與以上三種結(jié)合蛋白解離，并促使結(jié)合蛋白活化，而啟動(dòng)保護(hù)性的未折疊蛋白反應(yīng)[13]。適度的ERS，有助于改善蛋白質(zhì)的合成和加工過(guò)程，從而避免細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下?lián)p傷死亡，但若應(yīng)激反應(yīng)過(guò)久或過(guò)強(qiáng)，未折疊蛋白反應(yīng)不足以完全代償緩解細(xì)胞損傷，活化的跨膜感受蛋白將進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡程序，最終誘發(fā)應(yīng)激細(xì)胞程序性死亡[14]。PERK-eIF2α-CHOP通路為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的重要的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。應(yīng)激狀態(tài)下，PERK與GRP78解離后通過(guò)同源二聚化而磷酸化激活自身，促使轉(zhuǎn)錄活化因子4(the activating transcrip- tion factor 4，ATF4)的翻譯和表達(dá)，激活ERS特有的凋亡標(biāo)志蛋白CHOP的基因轉(zhuǎn)錄。CHOP的表達(dá)可調(diào)節(jié)死亡受體途徑和線粒體途徑，最終激活凋亡效應(yīng)子Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)豐富、發(fā)達(dá)，且持續(xù)暴露并與腸腔內(nèi)病原微生物接觸，病變時(shí)，受炎性介質(zhì)及缺血缺氧等刺激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)活躍。因此，調(diào)控腸上皮細(xì)胞ERS反應(yīng)，進(jìn)而抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸黏膜，并促進(jìn)其修復(fù)為改善UC的一重要途徑。

潰結(jié)康組方為白術(shù)、云茯苓、白芍、陳皮、防風(fēng)、桔梗、三七、槐花、地榆、甘草。全方具疏肝健脾，清熱涼血止血之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[15-18]表明，方中多味藥的藥效成分均具有調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用。本研究結(jié)合前期研究基礎(chǔ)及以上文獻(xiàn)報(bào)道，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為切入點(diǎn)，探討潰結(jié)康調(diào)控PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路促進(jìn)UC小鼠腸黏膜修復(fù)的機(jī)制。結(jié)果顯示，潰結(jié)康可逆轉(zhuǎn)UC小鼠體重降低及結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，改善結(jié)腸病理?yè)p傷。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)腸組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，潰結(jié)康可顯著下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白及調(diào)控蛋白GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α蛋白表達(dá)。表明潰結(jié)康對(duì)PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路具有一定的調(diào)控作用，提示干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路，減輕腸上皮細(xì)胞損傷及黏膜屏障破壞為潰結(jié)康改善UC的重要機(jī)制之一。研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了疏肝健脾方治療UC的療效機(jī)制的認(rèn)識(shí)。