蘋(píng)果酸補(bǔ)料策略提高枯草芽孢桿菌DF生長(zhǎng)和產(chǎn)孢效率

丁 躍，陳 琛，魯佳康，陳 雄，黃亞男，王 志,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.河南省南街村（集團(tuán)）有限公司，河南 漯河 462600）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生豐富的淀粉酶、蛋白酶等酶類(lèi)，分泌活性物質(zhì)抑制致病菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群[1]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有安全性能高、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于微生態(tài)制品和食品領(lǐng)域[2]。

枯草芽孢桿菌的高密度發(fā)酵是微生態(tài)制品生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，趙達(dá)等[3]通過(guò)優(yōu)化枯草芽孢桿菌B03的發(fā)酵培養(yǎng)基（3.0%玉米淀粉、6.0%豆粕等），搖瓶發(fā)酵66 h生物量達(dá)到1.06×1010CFU/mL；高同國(guó)等[4]在葡萄糖連續(xù)補(bǔ)料（維持在1%）、補(bǔ)氨水（維持pH 7.5～8.5）條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌16 h后，熱擊（50～80 ℃）15～60 min，生物量達(dá)到2.00×1010CFU/mL、芽孢數(shù)達(dá)到1.96×1010CFU/mL。Abuhena等[5]運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化的發(fā)酵條件通過(guò)3 m3發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，生物量達(dá)2.01×109CFU/mL。咸漠等[6]采用次序提高溫度（34～37 ℃）和通風(fēng)量（0.3～1.0 vvm）策略培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，發(fā)酵24 h生物量達(dá)到1.60×1010CFU/mL，芽孢率為96.0%。

芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程存在的氧化脅迫[7]與細(xì)胞氧化磷酸化、芬頓反應(yīng)以及NADPH氧化酶催化等代謝過(guò)程有關(guān)[8-10]，產(chǎn)生如超氧陰離子、H2O2等活性氧（reactive oxygen species，ROS）[11]。ROS大量積累引起細(xì)胞蛋白變性、脂質(zhì)過(guò)氧化及DNA斷裂等損傷[12]，而細(xì)胞通過(guò)氧化應(yīng)激[13]抵御氧化脅迫，如通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子PerR調(diào)控ROS清除酶（硫氧還蛋白還原酶TrxA、超氧化物歧化酶、H2O2酶KatA等）的表達(dá)。

磷酸化的Spo0A調(diào)控芽孢生成相關(guān)基因的表達(dá)效率，而KinA、KinB、Spo0F、Spo0B等組成的磷酸傳遞系統(tǒng)調(diào)控Spo0A的磷酸化水平[14]；另外，KipL（抑制KinA活性）、Sda（抑制KinB激酶活性）、RapA（抑制磷酸酶活性）等[15]抑制磷酸傳遞效率，降低Spo0A的磷酸化；KipA（抑制KipL活性）和ClpX（與Sda結(jié)合后能解除Sda對(duì)KinB的抑制作用）能促使KinA、KinB高效表達(dá)。而Phr（磷酸酶抑制蛋白）通過(guò)與Rap蛋白結(jié)合，提高Spo0F的磷酸化作用。因此，Spo0A的磷酸化是激酶、激酶抑制劑、磷酸傳遞蛋白及其調(diào)控蛋白共同作用的結(jié)果[16]。

AbrB蛋白也能調(diào)控芽孢的形成。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，AbrB通過(guò)抑制σH（SigH）的合成降低RNA聚合酶核心酶與σH的組裝效率，進(jìn)而阻遏spo0A基因的轉(zhuǎn)錄效率，使芽孢啟動(dòng)受到抑制；發(fā)酵環(huán)境不適合生長(zhǎng)時(shí)，abrB表達(dá)受阻遏，sigH轉(zhuǎn)錄水平增加，spo0A轉(zhuǎn)錄及Spo0A～P合成增強(qiáng)，進(jìn)而激活SpoIIE調(diào)控細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂[17]、促進(jìn)芽孢生成。

蘋(píng)果酸脫氫代謝生成草酰乙酸和NADH，后者作為氫載體參與能量代謝[18]，而草酰乙酸回補(bǔ)效率提高可以促進(jìn)三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)或糖異生途徑的運(yùn)轉(zhuǎn)[19]。另外，L-蘋(píng)果酸能夠捕獲自由基，具有抗氧化活性[20]。而蘋(píng)果酸應(yīng)用于枯草芽孢桿菌高密度發(fā)酵并調(diào)控產(chǎn)孢效率的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

在30 L發(fā)酵罐水平研究耦合pH 8.0流加蘋(píng)果酸對(duì)枯草芽孢桿菌DF生長(zhǎng)和芽孢生成的調(diào)控作用，旨在使蘋(píng)果酸增強(qiáng)糖異生和TCA循環(huán)等的運(yùn)轉(zhuǎn)效率、緩解氧化脅迫、提高芽孢組分的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和芽孢生成效率，為枯草芽孢桿菌高密度、高芽孢率發(fā)酵提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：枯草芽孢桿菌DF，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選、保藏的野生型菌株。

過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；RNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)安捷倫科技有限公司；甲醇賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。其余所有用于發(fā)酵培養(yǎng)的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所有用于氣相色譜分析的試劑均為色譜級(jí)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-30JS發(fā)酵罐 上海保興生物公司；ZXMP-A1230恒溫恒濕箱 上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JY02S紫外分析儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；7890B型氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

種子培養(yǎng)基、CFU計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：酵母浸膏20 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉20 g/L，調(diào)pH 7.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉30 g/L、豆粕50 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母浸膏3 g/L、蛋白胨8 g/L、輕CaCO33 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、MnSO4·H2O 0.3 g/L、30 mL泡敵，121 ℃滅菌30 min。

蘋(píng)果酸母液：270 g蘋(píng)果酸加水定容至600 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.3.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌DF從－80 ℃甘油管平板劃線(xiàn)轉(zhuǎn)接到平板瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑單菌落轉(zhuǎn)接至新鮮茄子瓶斜面（60 mL培養(yǎng)基/250 mL茄子瓶），37 ℃培養(yǎng)24 h，再向茄子瓶中加入50 mL無(wú)菌水，制備菌懸液接種至30 L發(fā)酵罐（18 L計(jì)料）發(fā)酵培養(yǎng)基中。

發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)速500 r/min、通氣量1 m3/h、罐壓0.045 MPa、溫度37 ℃。發(fā)酵13 h后溶氧量降至0，提高供氧強(qiáng)度（轉(zhuǎn)速由500 r/min提高到700 r/min，通氣量由1 m3/h提高到2 m3/h）。

補(bǔ)料方式：發(fā)酵16 h，pH 值回升至8.0 左右，16～27 h耦合pH 8.0補(bǔ)加蘋(píng)果酸母液。對(duì)照為不補(bǔ)蘋(píng)果酸的發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.3.3 細(xì)胞數(shù)和芽孢數(shù)的測(cè)定

細(xì)胞數(shù)：發(fā)酵液中細(xì)胞數(shù)（CFU/mL）采用稀釋涂布平板法[21]測(cè)定。

芽孢數(shù)：將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后的菌液80 ℃水浴15 min，后進(jìn)行平板涂布對(duì)芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)。產(chǎn)芽孢率計(jì)算如式（1）所示：

比生長(zhǎng)速率[22]計(jì)算如式（2）所示：

式中：μ為比生長(zhǎng)速率/h－1；x為生物量/（CFU/mL）；t為發(fā)酵時(shí)間/h。

1.3.4 H2O2濃度檢測(cè)

測(cè)定過(guò)程放置冰盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作[23]，現(xiàn)取現(xiàn)測(cè)。

1.3.5 乙酸質(zhì)量濃度檢測(cè)

發(fā)酵樣品（－20 ℃保存）經(jīng)12 000 r/min離心5 min，取上清液。采用內(nèi)標(biāo)法，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定[21]。

1.3.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

取對(duì)照（未補(bǔ)蘋(píng)果酸）和補(bǔ)料發(fā)酵（補(bǔ)蘋(píng)果酸）22 h（對(duì)數(shù)中后期）發(fā)酵液20 mL于50 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，無(wú)菌操作留取菌體沉淀并－80 ℃保存。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由美吉生物科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄表達(dá)定量分析TPM（transcripts per million）值按照式（3）[24]計(jì)算，差異倍數(shù)按（4）計(jì)算：

式中：R和L為需計(jì)算基因的read counts和基因長(zhǎng)度；Ri和Li（i＝1,2,…,n）為樣品中第i個(gè)基因的read counts和基因長(zhǎng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 30 L發(fā)酵罐水平枯草芽孢桿菌DF的發(fā)酵生長(zhǎng)特征

如圖1所示，pH值在發(fā)酵8 h降至最低值5.32（數(shù)據(jù)未顯示），后持續(xù)回升至16 h的8.0。22 h的pH值回升至8.79并維持至發(fā)酵結(jié)束。

圖1 30 L發(fā)酵罐水平菌株DF發(fā)酵生長(zhǎng)特征Fig.1 Growth characteristics of strain DF in a 30 L bioreactor

13～24 h 菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，生物量由13 h的5.47×109CFU/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至24 h達(dá)到峰值（2.14×1010CFU/mL）；同時(shí)芽孢數(shù)由13 h的2.77×109CFU/mL提高至24 h的1.89×1010CFU/mL，并在24 h達(dá)到最大芽孢率88.3%，發(fā)酵基本實(shí)現(xiàn)高密度水平。24～27 h，生物量及芽孢數(shù)分別由各自峰值快速下降至8.61×109、6.20×109CFU/mL，分別下降了59.7%、67.2%。說(shuō)明24 h后存在細(xì)胞生長(zhǎng)或芽孢形成的限制因素。

乙酸是芽孢桿菌典型的溢流代謝產(chǎn)物[25]，可由乙酰磷酸經(jīng)丙酮酸氧化酶（PoxL）、乙酸激酶/?；姿崦福╕flL）的次序催化生成（伴隨H2O2生成）。乙酸質(zhì)量濃度由13 h的0.96 g/L持續(xù)降至24 h的最低值（0.43 g/L），說(shuō)明發(fā)酵13 h時(shí)，葡萄糖代謝引起的“碳溢流”已停滯，乙酸作為儲(chǔ)備碳源被細(xì)胞吸收，并經(jīng)氧化呼吸代謝二次利用，這與馬文龍[26]的報(bào)道一致。另外，13～16 h比生長(zhǎng)速率（μ）為0.30 h－1，16～24 h的μ為0.06 h－1，比前者下降了80.0%，說(shuō)明乙酸16 h降至0.61 g/L時(shí)，已不足以維持細(xì)胞保持高生長(zhǎng)速率（μ＝0.30 h－1）。

2.2 耦合pH 8.0流加蘋(píng)果酸對(duì)菌株DF生長(zhǎng)和芽孢形成的影響

芽孢桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段發(fā)生“碳溢流”合成乙酸等有機(jī)酸，當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期碳源不足時(shí)溢流代謝產(chǎn)物（乙酸等）被利用，經(jīng)氧化呼吸代謝產(chǎn)能和糖異生作用進(jìn)行二次生長(zhǎng)[26]。因而，菌株DF發(fā)酵13 h后的能量供應(yīng)矛盾在于碳源（如乙酸等）的不足，這影響了細(xì)胞的二次生長(zhǎng)和芽孢生成效率。而蘋(píng)果酸能促進(jìn)TCA循環(huán)，同時(shí)提高糖異生途徑效率[19]，因而，考察耦合pH 8.0補(bǔ)料蘋(píng)果酸（16～27 h）對(duì)枯草芽孢桿菌DF生長(zhǎng)的影響（圖2）。

圖2 蘋(píng)果酸對(duì)枯草芽孢桿菌DF生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of malate on the growth of B.subtilis DF

pH值變化趨勢(shì)與對(duì)照基本一致，16 h回升至8.0（數(shù)據(jù)未顯示），耦合pH 8.0蘋(píng)果酸補(bǔ)料（16～27 h）過(guò)程維持在8.0左右。13～24 h菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生物量在13 h達(dá)到5.81×109CFU/mL，與對(duì)照（圖1）持平；22 h達(dá)到峰值3.68×1010CFU/mL，較對(duì)照（24 h，2.14×1010CFU/mL，圖1）提高了71.9%。芽孢數(shù)在13 h達(dá)到2.61×109CFU/mL（與對(duì)照接近）。而22 h芽孢數(shù)達(dá)到3.63×1010CFU/mL，較對(duì)照（22 h，1.89×1010CFU/mL，圖1）提高了92.1%，芽孢率為98.6%，較對(duì)照（圖1，芽孢率88.3%）提高了10.3%；而且19～22 h芽孢率維持在98%以上，芽孢率顯著提升。說(shuō)明耦合pH 8.0流加蘋(píng)果酸能有效促進(jìn)菌株DF生長(zhǎng)和芽孢形成。

16～27 h開(kāi)始流加蘋(píng)果酸（16～22 h補(bǔ)加390 mL、22～24 h補(bǔ)加90 mL、24～27 h補(bǔ)加120 mL）。13～16 h乙酸質(zhì)量濃度由1.08 g/L降低至0.71 g/L，其變化趨勢(shì)與對(duì)照一致。16～22、22～24 h和24～27 h蘋(píng)果酸流加速率分別為65、45 mL/h和40 mL/h（數(shù)據(jù)未顯示），乙酸積累至19 h的峰值（2.77 g/L），質(zhì)量濃度提高到16 h的3.90 倍，并于3 h后（22 h）降至最低值0.41 g/L。16～22 h細(xì)胞生長(zhǎng)速率幾乎未受影響，其μ為0.18 h－1，比對(duì)照16～24 h的μ（0.06 h－1）提高2 倍。說(shuō)明蘋(píng)果酸引起了“碳溢流”使乙酸合成效率增強(qiáng)，并作為儲(chǔ)備碳源支撐了16 h后細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖2）。

氧化磷酸化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子，并經(jīng)超氧化物歧化酶催化生成H2O2[10]。考慮到蘋(píng)果酸具有抗氧化作用[20]，其顯著促進(jìn)了芽孢桿菌DF的生長(zhǎng)（圖2），研究其是否會(huì)對(duì)其氧化應(yīng)激過(guò)程產(chǎn)生影響，測(cè)定了發(fā)酵過(guò)程過(guò)H2O2的濃度（圖3）。

圖3 蘋(píng)果酸對(duì)H2O2濃度的影響Fig.3 Effect of malate on the production of hydrogen peroxide

對(duì)照發(fā)酵的H2O2濃度由16 h的1 534 μmol/L快速積累，24 h達(dá)峰值（1 890 μmol/L），26 h降至1 091 μmol/L。而蘋(píng)果酸補(bǔ)料使H2O2濃度由16 h的1 477 μmol/L，下降至19 h的919 μmol/L，下降了37.78%，且在19～24 h維持穩(wěn)定，后下降至26 h的756 μmol/L。結(jié)果說(shuō)明，耦合pH 8.0補(bǔ)加蘋(píng)果酸可有效降低發(fā)酵過(guò)程H2O2濃度，16 h開(kāi)始流加蘋(píng)果酸后，H2O2濃度較對(duì)照（發(fā)酵19～24 h）下降45.9%～51.3%，有效降低了H2O2的生成。

2.3 蘋(píng)果酸對(duì)糖異生、磷酸戊糖途徑代謝的影響

對(duì)照組發(fā)酵16～24 h已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，乙酸含量在13～24 h呈明顯消耗狀態(tài)（圖1），說(shuō)明22 h細(xì)胞處于利用溢流分子-乙酸進(jìn)行氧化呼吸代謝的生理狀態(tài)，而B(niǎo)arwell[19]和黃雪松[21]等報(bào)道該狀態(tài)與發(fā)酵體系快速利用碳源不足和糖異生途徑有關(guān)。

CcpN是芽孢桿菌糖異生代謝調(diào)控蛋白，ccpN的高效表達(dá)將阻遏pckA（編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）及gapB（編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶）的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而限制糖異生代謝。而蘋(píng)果酸經(jīng)TCA循環(huán)代謝可對(duì)草酰乙酸進(jìn)行回補(bǔ)，進(jìn)而增強(qiáng)糖異生途徑[19]、TCA循環(huán)和NADH供應(yīng)。因而對(duì)糖異生和磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)差異進(jìn)行了分析，如圖4所示。

圖4 蘋(píng)果酸對(duì)糖異生、磷酸戊糖途徑代謝的影響Fig.4 Effect of malate on the gluconeogenesis and pentose phosphate pathways

蘋(píng)果酸補(bǔ)料發(fā)酵的ccpN表達(dá)下調(diào)了33.5%、pckA上調(diào)了38.0%、fbaA（編碼1,6-二磷酸果糖醛縮酶）上調(diào)了1.51 倍，說(shuō)明草酰乙酸向磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化效率提高，糖異生途徑加強(qiáng)。同時(shí)，zwf（編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）表達(dá)量提高了1.23 倍。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等催化葡萄糖-6-磷酸生成5-磷酸核酮糖和NADPH生成。而NADPH是ROS清除酶系最終的電子供體[10]，因而蘋(píng)果酸可通過(guò)糖異生及磷酸戊糖途徑代謝產(chǎn)生大量NADPH，加強(qiáng)了菌體氧化應(yīng)激的適應(yīng)性，從而提高生長(zhǎng)效率。這與發(fā)酵過(guò)程細(xì)胞生長(zhǎng)和芽孢生成效率顯著提高（圖2）的現(xiàn)象一致。

2.4 蘋(píng)果酸對(duì)TCA循環(huán)、溢流代謝的影響

TCA循環(huán)和丙酮酸節(jié)點(diǎn)溢流代謝的通路競(jìng)爭(zhēng)決定碳流的去向。TCA循環(huán)能夠提供大量的NADH和中間底物，而溢流代謝則生成乙酸等[27-28]。蘋(píng)果酸補(bǔ)料對(duì)菌株DF的TCA循環(huán)、溢流代謝基因表達(dá)的影響如圖5所示。

圖5 蘋(píng)果酸對(duì)TCA循環(huán)、溢流代謝的影響Fig.5 Effect of malate on the TCA cycle and overflow metabolism

citZ（編碼檸檬酸合酶）表達(dá)上調(diào)了2.10 倍，ppaC（編碼錳依賴(lài)型焦磷酸酶）催化ADP的合成，其表達(dá)水平上調(diào)了1.46 倍，說(shuō)明TCA循環(huán)碳流量通路增加，電子傳遞鏈末端磷酸化底物（ADP）供應(yīng)加強(qiáng)，促進(jìn)了能量代謝。

此外，22 h的poxL（編碼丙酮酸氧化酶）下調(diào)了72.9%，說(shuō)明經(jīng)由丙酮酸氧化酶生成H2O2的效率下降，降低了H2O2積累，這與發(fā)酵過(guò)程H2O2濃度顯著下降（圖3）的現(xiàn)象一致。而yflL（編碼?；姿崦福┫抡{(diào)了68.8%，這與22 h乙酸處于被二次利用的現(xiàn)象一致（圖2）。同時(shí)，acuB（編碼乙偶姻利用蛋白）轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了3.53 倍，也證實(shí)了溢流分子總體處于被二次利用的狀態(tài)。

值得注意的是，催化乙酰CoA生成乙醛的谷胱甘肽依賴(lài)型醛脫氫酶adhB上調(diào)了3.79 倍，減少了乙酰CoA的競(jìng)爭(zhēng)消耗、間接促進(jìn)了TCA循環(huán)對(duì)乙酰CoA的供應(yīng)，同時(shí)降低了乙醛積累對(duì)菌體生長(zhǎng)的毒性[29]，并緩解了其對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用。

2.5 蘋(píng)果酸對(duì)氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響

蘋(píng)果酸使得發(fā)酵中后期H2O2濃度下降45.9%～51.3%（圖3），因而分析了ROS清除系統(tǒng)關(guān)鍵酶的表達(dá)差異，如圖6所示。

圖6 蘋(píng)果酸對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激體系基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of malate on gene expression in the oxidative stress system

sodF（編碼超氧化物歧化酶）清除超氧陰離子[30]，其表達(dá)量上調(diào)了3.08 倍，降低了超氧陰離子的積累。PerR是氧化應(yīng)激阻遏蛋白[31]，perR表達(dá)下調(diào)，緩解了對(duì)超氧化物歧化酶的阻遏、促進(jìn)了超氧陰離子的清除。

過(guò)氧化物酶PRDX在清除H2O2的過(guò)程中需要硫氧還原蛋白還原酶TRXR（由trxA編碼）的動(dòng)態(tài)還原以恢復(fù)活性[32]，trxA上調(diào)了2.88 倍（P＜0.001）。同時(shí)，H2O2酶katE表達(dá)量較對(duì)照下調(diào)了74.5%。說(shuō)明H2O2的清除主要由PRDX-TRXR系統(tǒng)完成。蘋(píng)果酸使PRDX-TRXR組成的H2O2清除系統(tǒng)效率更高，有效降低了H2O2的生成效率、緩解了脅迫強(qiáng)度（圖3），進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)（圖2），這也與蘋(píng)果酸補(bǔ)料使發(fā)酵過(guò)程H2O2濃度顯著下降（圖3）的結(jié)果一致。

2.6 蘋(píng)果酸對(duì)芽孢生成效率的影響

Spo0A作為決定產(chǎn)孢啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子，其自身的磷酸化水平是否達(dá)到一定閾值決定了芽孢形成過(guò)程是否開(kāi)始[16]。當(dāng)abrB的表達(dá)受抑制，sigH過(guò)表達(dá)，Spo0A自身表達(dá)量上調(diào)[33]。磷酸化的Spo0A激活spoIIE的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂，芽孢過(guò)程啟動(dòng)。

蘋(píng)果酸對(duì)菌株DF芽孢生成相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖7所示，kipL（激酶KinA的抑制劑）下調(diào)了75.9%、clpX上調(diào)了2.67 倍（ClpX與Sda結(jié)合，解除Sda對(duì)KinB激酶的抑制作用）；phrC、phrF高效表達(dá)（分別上調(diào)了12.76、9.09 倍）使得rapA、rapD（Spo0F去磷酸化）分別下調(diào)了58.2%、57.5%，共同增強(qiáng)了KinA和KinB參與的磷酸傳遞效率（Spo0F是磷酸根受體）。另外，磷酸傳遞系統(tǒng)的spo0B（編碼Spo0B）表達(dá)量上調(diào)了73.0%，也有利于磷酸基團(tuán)向Spo0A的傳遞。

圖7 蘋(píng)果酸對(duì)芽孢生成效率的影響Fig.7 Effect of malate on the sporulation efficiency

菌體快速生長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AbrB阻遏sigH的表達(dá)，使Spo0A的磷酸化處于較低水平。相反Spo0A的磷酸化增強(qiáng)，可抑制abrB的表達(dá)，使sigA（編碼SigA，能與RNA核心酶結(jié)合）脫阻遏，促進(jìn)spo0A基因表達(dá)。蘋(píng)果酸補(bǔ)料時(shí)，abrB表達(dá)下調(diào)了65.9%、sigA表達(dá)上調(diào)了2.45 倍，間接提高了Spo0A的磷酸化水平。

結(jié)果說(shuō)明，蘋(píng)果酸增強(qiáng)了菌株DF芽孢程序啟動(dòng)的效率，促進(jìn)了Spo0A～P的生成和積累。這與蘋(píng)果酸促進(jìn)菌體芽孢生成效率的結(jié)果（圖2）一致。

3 結(jié)論

高芽孢率是枯草芽孢桿菌應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)和微生態(tài)領(lǐng)域的基礎(chǔ)條件，耦合pH 8.0流加蘋(píng)果酸補(bǔ)料增強(qiáng)了芽孢桿菌DF細(xì)胞sodF、trxA等抗氧化酶基因的表達(dá)強(qiáng)度，降低了發(fā)酵過(guò)程H2O2濃度，緩解了細(xì)胞氧化損傷。同時(shí)，通過(guò)強(qiáng)化糖異生途徑和TCA循環(huán)促進(jìn)了NADH、NADPH的合成，提高了能量供應(yīng)效率，使菌株DF生物量達(dá)到3.7×1010CFU/mL，較對(duì)照（未補(bǔ)蘋(píng)果酸）提高71.9%；芽孢數(shù)達(dá)到3.6×1010CFU/mL，較對(duì)照提高92.1%，顯著提高了生長(zhǎng)和芽孢生成效率。研究結(jié)果可為枯草芽孢桿菌高密度、高芽孢率發(fā)酵提供理論和技術(shù)支撐。