甜瓜HDM基因家族鑒定及特性分析

張治，張婧，張瑾，哈斯阿古拉，郝金鳳

研究報(bào)告

甜瓜HDM基因家族鑒定及特性分析

張治，張婧，張瑾，哈斯阿古拉，郝金鳳

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010070

組蛋白去甲基化酶(histone demethylase，HDM)是生物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)甜瓜(L.) HDM基因家族進(jìn)行了鑒定，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢測(cè)了其成員在甜瓜組織的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，在甜瓜基因組中鑒定得到了20個(gè)基因，在各條染色體上非均勻分布；其成員可以分成LSD1和JmjC兩大類，而JmjC類群又可劃分為5個(gè)亞群，各類群成員數(shù)量不等；種內(nèi)和種間的共線性關(guān)系顯示，甜瓜基因僅存在一對(duì)片段重復(fù)，與番茄()基因共線性區(qū)域較多，親緣關(guān)系較近；各成員所含保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量不等，且外顯子和內(nèi)含子在數(shù)量上有所差異；在啟動(dòng)子區(qū)域存在多種與激素和環(huán)境信號(hào)響應(yīng)的順式作用元件，表達(dá)特性分析顯示各基因成員在甜瓜雄花、雌花、根、莖、葉、子房和成熟果實(shí)中均存在不同程度的表達(dá)。這些結(jié)果將有助于更好地理解基因的潛在功能以及它們?cè)趨⑴c調(diào)節(jié)甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境自適中可能發(fā)揮的作用。

甜瓜；HDM家族；基因鑒定；表達(dá)分析

在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，染色質(zhì)對(duì)基因表達(dá)和環(huán)境的反應(yīng)非常重要。染色質(zhì)的調(diào)控是不涉及DNA序列改變情況下，通過(guò)改變DNA和組蛋白修飾來(lái)調(diào)節(jié)真核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)的一種重要機(jī)制[1]。染色質(zhì)由核小體組成，核小體由一條長(zhǎng)約146 bp的DNA纏繞組蛋白修飾位點(diǎn)形成八聚體結(jié)構(gòu)(H2A、H2B、H3和H4各有兩個(gè)分子)[2]，H1作為連接蛋白，將核小體逐個(gè)連接起來(lái)呈念珠狀。組蛋白有許多共價(jià)修飾，常見(jiàn)的方式包括組蛋白乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等[3]，并且組蛋白修飾具有多樣性，相互之間能夠形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)參與染色質(zhì)介導(dǎo)的多種生命活動(dòng)[4]。

組蛋白甲基化作為組蛋白修飾的主要方式之一，在基因組水平上對(duì)染色質(zhì)構(gòu)型和基因表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。組蛋白甲基化主要發(fā)生在組蛋白H3、H4的賴氨酸和精氨酸殘基上[5]，其中賴氨酸殘基可以被單、二、三甲基化修飾，而精氨酸殘基只能被單甲基化、不對(duì)稱或?qū)ΨQ二甲基化修飾，這可能是受到了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的雙重調(diào)節(jié)[6～8]。在植物中，組蛋白賴氨酸甲基化在組蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79位點(diǎn)和H4K20位點(diǎn)均存在修飾作用[9～11]。一般來(lái)說(shuō)，組蛋白H3相關(guān)位點(diǎn)的甲基化修飾作用存在著差異性，K4、K36、K79位點(diǎn)的甲基化修飾主要與轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)，而K9、K27位點(diǎn)的甲基化修飾與轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)[12]。

目前，已知進(jìn)化上保守的組蛋白賴氨酸去甲基化酶主要有賴氨酸特異性去甲基化酶1 (LSD1)和含有Jumonji C端(JmjC)結(jié)構(gòu)域蛋白的去甲基化酶兩種，并且這兩類去甲基化酶通過(guò)不同的途徑發(fā)揮其去甲基化作用[13,14]。LSD1需要黃素腺嘌呤二核苷酸為輔助因子，而JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白需要Fe(II)和α-酮戊二酸(αKG)為輔助因子，作用于組蛋白賴氨酸去甲基化修飾過(guò)程[15,16]。含有JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白是一種很重要的組蛋白賴氨酸去甲基化酶，其在維持體內(nèi)組蛋白甲基化的動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用[17,18]。根據(jù)序列相似性和催化特異性，植物中JmjC類群進(jìn)一步又可以被劃分為5個(gè)亞群：KDM5/JARID1、KDM4/ JHDM3、KDM3/JHDM2、JMJD6和JmjC domain- only[19]。有研究報(bào)道，一些植物JmjC基因家族成員在多個(gè)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括影響花期[20,21]、葉片、花序及種子的形態(tài)[22,23]、生物節(jié)律[24]、芽的再生[25]、莖的伸長(zhǎng)[26]等過(guò)程。另外，其在響應(yīng)鹽脅迫、熱脅迫、干旱脅迫等逆境反應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮著十分重要的作用[1,27,28]。

甜瓜(L.)是葫蘆科最重要的二倍體作物之一，其果實(shí)含有可溶性糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)和維生素[29]。甜瓜具有很重要的經(jīng)濟(jì)和園藝價(jià)值，在世界各地均有種植[30]。目前，通過(guò)生物信息學(xué)方法已完成了擬南芥()[19]、水稻()[19]、玉米()[5]、大豆()[31]和月季()[18]等組蛋白去甲基化酶(histone demethylases，HDMs)中JmjC基因家族成員的鑒定，但迄今為止對(duì)甜瓜基因尚未進(jìn)行鑒定和功能研究。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)甜瓜HDM基因家族成員進(jìn)行搜索和鑒定，并對(duì)鑒定得到的家族成員的蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、保守功能域、染色體分布、基因表達(dá)等特性進(jìn)行了分析，以期為后續(xù)闡明CmHDM的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 甜瓜HDM基因家族成員的鑒定與分類注釋

從葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)CuGenDB (http://www.cucur-bitgenomics.org/)獲取甜瓜(v3.6.1)全基因組序列和蛋白質(zhì)相關(guān)信息。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載HDM中JmjC和LSD1蛋白保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫(HMM)模型文件，并利用TBtools搜索甜瓜基因組蛋白序列，參數(shù)為默認(rèn)值。同時(shí)，以擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(25個(gè)成員) HDM氨基酸序列為參考序列，基于BioEdit7.2.0軟件建立本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行本地Blastp蛋白比對(duì)(值為10–3)以獲取同源性較高的序列。通過(guò)以上兩種方法獲得CmHDM基因家族成員的潛在候選序列，并提交至SMART數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，選擇具有完整HDM中LSD1和JmjC基因家族特有保守域的成員進(jìn)行后續(xù)分析，并參考成員所在的染色體以及在染色體上的位置進(jìn)行命名。

1.2 甜瓜HDM基因家族蛋白理化特性和染色體定位

通過(guò)在線網(wǎng)頁(yè)ExPASy預(yù)測(cè)CmHDM蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量等理化性質(zhì)。利用WoLF PSORT在線工具進(jìn)行其成員亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。根據(jù)基因在染色體的位置信息，使用TBtools繪制CmHDM家族染色體物理圖譜。

1.3 甜瓜HDM基因家族結(jié)構(gòu)、編碼蛋白結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化分析

根據(jù)CmHDM家族基因GFF注釋文件信息，對(duì)其外顯子及內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。通過(guò)SMART數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)提交的成員蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，并利用TBtools軟件進(jìn)行可視化。在MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)網(wǎng)站分析CmHDM蛋白序列的保守基序(motif)并對(duì)其進(jìn)行可視化分析。采用MEGA 7.0通過(guò)鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建甜瓜、擬南芥、番茄()HDM基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中模式采用Poisson correction模型，數(shù)據(jù)缺失設(shè)置為Pairwise deletion，Bootstrap運(yùn)行次數(shù)為1000，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.4 甜瓜HDM基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

從甜瓜全基因組序列中提取CmHDM家族成員起始密碼子上游2000 bp序列，提交至Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/plantcare/html/)，對(duì)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.5 甜瓜HDM基因家族復(fù)制和共線性分析

為了研究甜瓜基因是否包含串聯(lián)重復(fù)或片段復(fù)制，通過(guò)MCScanX軟件對(duì)基因的重復(fù)事件進(jìn)行分析。為了研究甜瓜基因和擬南芥、番茄物種之間的復(fù)制關(guān)系，利用TBtools軟件進(jìn)行共線性關(guān)系分析并繪制。

1.6 甜瓜HDM基因家族表達(dá)模式分析

為探究甜瓜HDM基因家族在不同組織器官中的表達(dá)差異，從NCBI SAR數(shù)據(jù)庫(kù)下載甜瓜植株的根、莖、葉、雌花、雄花、子房(登錄號(hào)：PRJNA803327)以及成熟果實(shí)組織(登錄號(hào)：PRJNA543288)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將其中基因的相關(guān)數(shù)據(jù)篩選并提交至TBtools進(jìn)行熱圖繪制，從表達(dá)模式推測(cè)其在甜瓜發(fā)育中可能發(fā)揮的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜HDM基因的鑒定和蛋白理化性質(zhì)分析

通過(guò)序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定到20個(gè)甜瓜HDM基因家族成員，其中17個(gè)基因和3個(gè)基因。根據(jù)各基因所在染色體及染色體上的位置依次進(jìn)行命名，即～和～(附表1)。蛋白理化特性分析發(fā)現(xiàn)，CmJMJ蛋白長(zhǎng)度為413～1817 aa，蛋白分子量為52,175.9～208,706.01 Da，其中CmJMJ15蛋白分子量最大，CmJMJ04蛋白分子量最小。CmJMJ不穩(wěn)定系數(shù)在37.95～60.48之間，等電點(diǎn)范圍在4.57～8.84，其中酸性氨基酸占64.71%，堿性氨基酸占35.29%。而CmLSD1蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)的是CmLSD02 (1934 aa)，其次是CmLSD01 (906 aa)，CmLSD03最短(886 aa)。蛋白分子量為98,220.41～ 211,756.59 Da，不穩(wěn)定系數(shù)在38.31～45.20之間，CmLSD01和CmLSD03為堿性蛋白，CmLSD02為酸性蛋白。CmHDM基因家族成員均為親水性蛋白，其大部分成員預(yù)測(cè)分布于細(xì)胞核，個(gè)別分布于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體。

2.2 甜瓜HDM基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析

為探究甜瓜基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化，本研究分析了甜瓜與擬南芥和番茄之間的同源進(jìn)化關(guān)系。使用ClustalW對(duì)20個(gè)CmHDM、25個(gè)AtHDM和SlHDM的編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，借助MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。參照擬南芥分類方法，甜瓜HDM成員被分成LSD1和JmjC兩大類(圖1)，LSD1蛋白類群有3個(gè)成員(LSD01～03)，在甜瓜JmjC域蛋白類群中，包括4個(gè)KDM3/JHDM2 (CmJMJ10、11、13和14)、4個(gè)KDM4/JHDM3 (CmJMJ05、07、12和17)、4個(gè)KDM5/JARID1 (CmJMJ01、09、15和16)、2個(gè)JMJD6 (CmJMJ06和08)和3個(gè)JmjC domain-only (CmJMJ02～04)。整體來(lái)說(shuō)，甜瓜(20個(gè))與擬南芥(25個(gè))、番茄(25個(gè)) HDM基因家族成員在各亞族分布均勻，數(shù)量上相差不大，表明三者HDM基因家族成員在進(jìn)化過(guò)程中具有一定相似性。

在基因表達(dá)和調(diào)控過(guò)程中，內(nèi)含子的數(shù)量和位置非常重要。通過(guò)對(duì)甜瓜HDM基因家族基因結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)(圖2A)，各成員均含有內(nèi)含子和外顯子且彼此間含有的個(gè)數(shù)不相同，3個(gè)基因中內(nèi)含子最多有7個(gè)()，最少2個(gè)()；17個(gè)基因中內(nèi)含子最多有35個(gè)()，最少1個(gè)()。為了進(jìn)一步解析CmHDM家族基因的功能，本研究使用TBtools軟件分析了CmHDM蛋白的保守motif和motif微標(biāo)(圖2，B和C)，發(fā)現(xiàn)不同亞族之間保守基序組成有所差異，但各亞族間保守基序基本相同。其中，KDM3/JHDM2均存在motif4、motif5、motif7、motif10、motif11和motif12，KDM4/JHDM3和KDM5/JARID1均存在motif1、motif2和motif15，JMJD6和JmjC domain-only均存在motif8，LSD1類群蛋白均存在motif8、motif13和motif14，同時(shí)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中關(guān)系密切的成員往往具有相同的motif，表明CmHDM家族各亞族基因的結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上具有極高的保守性和相似性，可能具有相同的生物學(xué)功能。

圖1 甜瓜與擬南芥、番茄HDM蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

綠色圓點(diǎn)：(擬南芥)；黃色圓點(diǎn)：(甜瓜)；紅色圓點(diǎn)：(番茄)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)外圈用6種不同顏色的弧線分別表示LSD1、KDM3/JHDM2、KDM4/JHDM3、KDM5/JARID1、JMJD6和JmjC domain-only亞家族。

圖2 甜瓜HDM家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守motif分析

A：基因結(jié)構(gòu)；B：保守motif；C：motif序列微標(biāo)(每個(gè)字母的高度表示該位置氨基酸的出現(xiàn)頻率)。UTR：untranslated region (非翻譯區(qū))；CDS：coding sequence (編碼序列)。

在編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)(圖3)，LSD1蛋白類群N末端含有SWIRM結(jié)構(gòu)域和C末端含有胺氧化酶活性的Amino oxidase結(jié)構(gòu)域，它們共同發(fā)揮相應(yīng)作用。在含JmjC域蛋白類群中，除了JmjC domain-only亞族成員僅有JmjC結(jié)構(gòu)域，而其他亞族成員不僅包含JmjC結(jié)構(gòu)域，還主要具有JmjN、F-box、FYRN、FYRC、ARID和RING等蛋白結(jié)構(gòu)域，它們的去甲基化功能不僅依賴于JmjC結(jié)構(gòu)域還依賴于其他的結(jié)構(gòu)域，并且它們的作用方式存在特異性。

2.3 甜瓜HDM基因染色體定位、基因復(fù)制分析

在甜瓜12條染色體中(圖4)，20個(gè)HDM家族成員分布不均且有所差異，其成員主要分布在1、2、3、4、5、6、8、9和12號(hào)染色體上，而在7、10和11號(hào)染色體上沒(méi)有成員分布，除8號(hào)染色體僅存在一個(gè)基因外，其他染色體均存在兩個(gè)或兩個(gè)以上基因?；蚣易逯饕臄U(kuò)增方式分為串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)，根據(jù)MCscan結(jié)果顯示(圖5)，在20個(gè)組蛋白去甲基化酶基因(和)中，僅在JmjC家族存在一對(duì)片段重復(fù)(和)，且均不存在串聯(lián)重復(fù)，表明甜瓜組蛋白去甲基化酶基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)獨(dú)立。

2.4 甜瓜HDM基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的順式作用元件在調(diào)控植物對(duì)逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮了十分重要的作用。本研究通過(guò)Plant CARE軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，甜瓜HDM家族啟動(dòng)子區(qū)域除了含有大量的核心元件CAAT-box和TATA-box以外，其他主要分為植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素和環(huán)境信號(hào)響應(yīng)三類：與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件包括分生組織表達(dá)CAT-box、胚乳表達(dá)GCN4-motif、生理節(jié)律調(diào)節(jié)Circadian等；與植物激素響應(yīng)有關(guān)的元件包括生長(zhǎng)素AuxRR-core、赤霉素GARE-motif、茉莉酸CGTCA-motif、TGACG-motif和脫落酸ABRE等；與環(huán)境信號(hào)相關(guān)的包括光應(yīng)答B(yǎng)ox4和AE-box、低溫誘導(dǎo)LTR、干旱誘導(dǎo)MBS等應(yīng)答元件。

圖3 甜瓜HDM家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 甜瓜HDM家族成員染色體定位

圖5 甜瓜HDM家族成員共線性分析

紅色線條表示甜瓜HDM家族成員間存在片段復(fù)制基因?qū)Α?/p>

圖6 甜瓜HDM家族成員啟動(dòng)子順式元件分析

其中，環(huán)境信號(hào)光響應(yīng)元件在20個(gè)基因中均存在，尤其是低溫誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)元件較多；植物激素生長(zhǎng)素和茉莉酸元件占65%，脫落酸和赤霉素元件占75%此；外45%成員有玉米膠蛋白代謝調(diào)節(jié)元件O2-site。存在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)元件MES-like，和存在創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif等特殊順式作用元件，表明這類基因可能在參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.5 甜瓜HDM基因與不同物種間共線性分析

為了更好的理解組蛋白去甲基化酶基因在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系，本研究選取擬南芥、番茄及甜瓜的基因組進(jìn)行了共線性分析(圖7)。分析結(jié)果表明，甜瓜與番茄基因存在14對(duì)共線性關(guān)系，而與擬南芥基因存在12對(duì)共線性關(guān)系，兩者數(shù)量上區(qū)別不大，番茄相對(duì)于擬南芥，與甜瓜親緣關(guān)系更近，共線性區(qū)域較多。

在20個(gè)甜瓜基因中，有4個(gè)基因(、、和)和1個(gè)基因()與擬南芥和番茄都不存在共線性關(guān)系，其他基因均與擬南芥、番茄同源基因存在共線性關(guān)系。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)有一些基因至少與2個(gè)同線基因?qū)τ嘘P(guān)，如和能夠與番茄同源基因形成2個(gè)同線基因?qū)Γ聹y(cè)這些基因可能在植物的進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用，然而這些基因在擬南芥基因組并未出現(xiàn)一對(duì)多的共線性關(guān)系，表明甜瓜和擬南芥在分化之后并沒(méi)有發(fā)生基因家族復(fù)制事件，在進(jìn)化過(guò)程中還是處于較保守的狀態(tài)。此外，在甜瓜、擬南芥和番茄中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)共線基因?qū)?，包括、、、、、、和，這可能是最早存在于植物中的組蛋白去甲基化酶基因，能夠在不同的組織結(jié)構(gòu)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。

圖7 甜瓜、擬南芥和番茄之間HDM基因共線性分析

淺灰色線條表示甜瓜基因組分別與擬南芥和番茄基因組之間的共線性區(qū)塊；不同彩色線條表示共線性區(qū)塊中LSD1和JmjC不同亞族基因的位置(各亞族基因所用的線條顏色與圖1所用顏色對(duì)應(yīng))。

2.6 甜瓜HDM基因表達(dá)模式分析

基因在植物不同組織的表達(dá)特性能夠很好的揭示其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)甜瓜基因在雌花、雄花、成熟果實(shí)、根、莖、葉和子房等組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析(圖8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20個(gè)基因在甜瓜的不同組織部位均存在不同水平的表達(dá)(附表2)。其中，、、、和在甜瓜的不同組織中均具有較高的表達(dá)水平，而在各個(gè)組織的表達(dá)水平相對(duì)較低。在雌花中的表達(dá)量最高，和次之，而在雄花中的表達(dá)量最高，和次之，這些基因在甜瓜的花器官發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮功能，并且發(fā)現(xiàn)CmLSD1基因家族成員可能主要參與甜瓜花器官的調(diào)控過(guò)程。在甜瓜的莖和葉表達(dá)水平較高，僅在根中表達(dá)較高，在其他組織表達(dá)較低。、和在子房中有顯著表達(dá)，推測(cè)這些基因在子房發(fā)育時(shí)期影響甜瓜果實(shí)的發(fā)育。和較其他基因在成熟果實(shí)中有較高的表達(dá)水平，推測(cè)它們?cè)谔鸸瞎麑?shí)成熟過(guò)程中起著重要作用。以上結(jié)果表明，基因在參與甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了不同程度的作用。

3 討論

組蛋白甲基化和去甲基化修飾在基因表達(dá)的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，主要受組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶的動(dòng)態(tài)調(diào)控，能夠通過(guò)修飾不同位點(diǎn)或不同程度的甲基化水平來(lái)調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。本研究從甜瓜全基因組中鑒定到20個(gè)基因(3個(gè)和17個(gè))，這些基因在9條染色體上非均勻分布，相對(duì)于擬南芥(4個(gè)和21個(gè))[32]、番茄(5個(gè)和20個(gè))[6]成員數(shù)量較少。參照擬南芥HDM系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分類，甜瓜HDM被分成LSD1和JmjC兩大類，而JmjC類群又被劃分為KDM3/JHDM2、KDM4/ JHDM3、KDM5/JARID1、JMJD6和JmjC domain-only五類亞群，JMJD6類群成員與擬南芥和番茄數(shù)量一致，而其他類群成員數(shù)量略有差異，這可能與JMJD6類群在進(jìn)化中高度保守有關(guān)。在基因復(fù)制事件中，甜瓜HDM家族僅存在一對(duì)片段重復(fù)，而無(wú)串聯(lián)重復(fù)事件，表明基因在進(jìn)化過(guò)程中具有相對(duì)獨(dú)立性。甜瓜基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，LSD1蛋白類群均含有SWIRM和Amino oxidase結(jié)構(gòu)域，JmjC蛋白亞家族都含有特定的JmjC結(jié)構(gòu)域，其生物學(xué)功能的發(fā)揮還依靠于其他結(jié)構(gòu)域，并且具有底物特異性。

圖8 甜瓜HDM基因在不同組織的表達(dá)分析

采用植株模擬卡通圖和熱圖兩種形式展示甜瓜基因在根、莖、葉、雌花、雄花、子房、成熟果實(shí)中的表達(dá)情況。紅色表示表達(dá)量高，藍(lán)色表示表達(dá)量低。

在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中靈活而穩(wěn)健的基因表達(dá)和對(duì)環(huán)境的反應(yīng)主要受到表觀遺傳的調(diào)控，而組蛋白去甲基化修飾在這個(gè)過(guò)程中扮演了重要的角色，主要影響植物花期、葉片的衰老、生物節(jié)律調(diào)控、體外芽的再生、莖的伸長(zhǎng)等過(guò)程。啟動(dòng)子上游的順式作用元件能夠參與基因表達(dá)的調(diào)控，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及植物對(duì)逆境(生物和非生物脅迫)的響應(yīng)。本研究分析發(fā)現(xiàn)，甜瓜HDM基因家族具有一些與ABA、GA等激素及光、干旱等環(huán)境信號(hào)響應(yīng)的元件，表明基因可能在參與調(diào)控甜瓜的非生物脅迫中發(fā)揮了不可或缺的作用，也為后續(xù)開(kāi)展基因通過(guò)激素介導(dǎo)和環(huán)境信號(hào)脅迫調(diào)節(jié)甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育研究提供了思路。甜瓜HDM基因家族在根、莖、葉、雄花、雌花、子房以及果實(shí)中均有不同程度表達(dá)，說(shuō)明在不同組織部位中發(fā)揮著不同的功能。CmLSD1基因家族成員在花組織表達(dá)比較集中，可能參與對(duì)甜瓜花器官的調(diào)控，這與擬南芥LSD1家族的同源蛋白LDL1和LDL2的功能相似，具有H3K4去甲基化酶催化活性[33]并能夠影響植株開(kāi)花。、等基因在花中表達(dá)量較高，推測(cè)在甜瓜的花器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，如水稻能參與調(diào)控花的形態(tài)發(fā)育和花器官數(shù)目的變化[34]。在葉和莖中表達(dá)較高，而擬南芥能夠正向調(diào)節(jié)葉片衰老[22]，水稻可以通過(guò)H3K4me1/2/3去甲基化調(diào)節(jié)莖的伸長(zhǎng)和植株的生長(zhǎng)[35]，推測(cè)基因可能具有相似的功能。

肉質(zhì)果實(shí)成熟是一個(gè)獨(dú)特的發(fā)育過(guò)程。果實(shí)成熟過(guò)程是由內(nèi)源激素(如乙烯)和遺傳調(diào)控因子(如轉(zhuǎn)錄因子)驅(qū)動(dòng)完成，然而，目前對(duì)肉質(zhì)果實(shí)成熟的關(guān)鍵和早期調(diào)節(jié)因子還知之甚少。2020年，Li等[6]首次報(bào)道，是一種專一性的H3K27me3組蛋白去甲基化酶，通過(guò)對(duì)一些成熟相關(guān)基因的去甲基化，從而正向調(diào)控番茄果實(shí)成熟。隨后，Ding等[36]發(fā)現(xiàn)是番茄果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)H3K4me3去甲基化直接調(diào)控一組關(guān)鍵的成熟相關(guān)基因，包括乙烯生物合成基因(、和)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(RIN和NOR)、品質(zhì)形成相關(guān)基因(、、、、和等)，從而調(diào)控果實(shí)成熟。同樣，本研究在甜瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)、和在子房組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織，猜測(cè)這些基因可能在子房發(fā)育時(shí)期影響甜瓜果實(shí)的發(fā)育。、較其他基因在成熟果實(shí)中有較高的表達(dá)水平，可能在參與甜瓜果實(shí)成熟中發(fā)揮重要的作用。

HDM在參與調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和環(huán)境自適中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但在不同類型植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆抗病的功能方面還有待研究。目前，關(guān)于HDM在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和抗逆抗病的分子機(jī)制及途徑尚未明朗，因而解析這些機(jī)理過(guò)程對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境自適尤為必要。通過(guò)對(duì)甜瓜HDM基因家族的特性分析，將為后期研究基因如何動(dòng)態(tài)調(diào)控甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Identification and characterization analysis of the HDM gene family in melon (L.)

Zhi Zhang, Jing Zhang, Jin Zhang, Agula Hasi, Jinfeng Hao

Histone demethylase (HDM) play crucial roles in regulating plant growth and environmental adaptation. In this study, the HDM gene family in melon was identified by bioinformatics methods and the expression patterns of theCmHDM family members in different melon tissues were analyzed using transcriptome data. The results showed that 20genes were identified in the melon genome, which were unevenly distributed across each chromosome. These members fall into two major categories: LSD1 and JmjC. The JmjC group could be further divided into five subgroups with different numbers. The results of collinearity analysis of intraspecific and interspecific relationships showed that there were only one pair of segmental duplication in melongenes, and more collinearity in genetic relationship ofgenes between melon and tomato. The numbers of conserved domains, exons and introns in each member vary and various-acting elements responding to hormones and environmental signals existed in the respective promoter regions. Expression analysis showed that the respective gene members were expressed at different levels in male flowers, female flowers, roots, stems, leaves, ovary, and mature fruits of melon. These results will contribute to the understanding on the potential functions of thegenes and their potential functions in regulating melon growth and environmental adaptation.

melon; HDM family; gene identification; expression analysis

2023-08-23;

2023-09-25;

2023-10-25

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2020MS03025)資助[Supported by the Inner Mongolia Natural Science Foundation (No.2020MS03025)]

張治，碩士研究生，專業(yè)方向：植物學(xué)。E-mail: 1819296047@qq.com

郝金鳳，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)及基因工程。E-mail: haojindd@163.com

10.16288/j.yczz.23-226

(責(zé)任編委: 許勇)