基于無透鏡衍射成像的豬精子三維軌跡提取方法研究

李國曉，姜玥彤，李晨曦，武君偉

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江；2.連云港立華牧業(yè)有限公司，江蘇 連云港）

引言

在生豬養(yǎng)殖等領(lǐng)域，精液質(zhì)量評估是促進(jìn)生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其中一個重要指標(biāo)——精子活力，是指精液中呈前進(jìn)運(yùn)動的精子所占的百分率。傳統(tǒng)的手工分析方法是用顯微鏡進(jìn)行觀察，對精子運(yùn)動情況進(jìn)行人工判斷和計(jì)數(shù)，該方法對檢測人員要求高，主觀性強(qiáng)，準(zhǔn)確度低。隨著圖像采集和處理技術(shù)的快速發(fā)展，CASA（計(jì)算機(jī)輔助精子分析）被廣泛應(yīng)用[1]，通過處理分析精子顯微鏡圖像及視頻，對精子運(yùn)動特征進(jìn)行量化，大大提高了自動化程度和客觀性。其成像裝置為相差顯微鏡，要求被測目標(biāo)處于近軸區(qū)域的焦平面上，成像視野小、設(shè)備體積大、造價(jià)高。而且，所獲得的精子運(yùn)動情況是一種二維表現(xiàn)[2]。而事實(shí)上，精子是在三維空間中游動的，現(xiàn)有方法對其運(yùn)動性能的評估不夠科學(xué)。三維運(yùn)動軌跡不僅是精子活力分析的重要依據(jù)，更是研究精子在特定物質(zhì)作用下運(yùn)動趨化性能的重要依據(jù)，具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景[3]。

無透鏡衍射成像技術(shù)，因其高通量、樣本無需位于焦平面等特點(diǎn)，在生物細(xì)胞、細(xì)菌等微顆粒分析中展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢，已成功用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞和微顆粒分類、細(xì)胞活性檢測等。本研究提出了一種基于無透鏡衍射成像技術(shù)的豬精子三維運(yùn)動軌跡提取方法。與此同時，該方法自動化程度高，設(shè)備便攜性強(qiáng)，設(shè)備造價(jià)大幅降低。

1 豬精子無透鏡衍射成像原理和裝置設(shè)計(jì)

1.1 成像原理

正常公豬的精子大約為45 μm，由頭部和尾部組成，其中，頭部呈透明的橢球狀，其光學(xué)性能類似于一個凸透鏡。豬精子無透鏡衍射成像原理如圖1（a）所示，精子個體在近似平面波的照射下，一部分從其周圍的均勻介質(zhì)透射過，另一部分從其內(nèi)部透射過，其幅值和相位被調(diào)制，由于兩部分透射光具有相同的初始相位，在成像平面上將發(fā)生穩(wěn)定的干涉條紋，該條紋中必然蘊(yùn)含生物樣本的光學(xué)形態(tài)信息。為獲得明顯的干涉條紋，這要求入射光具有較好的空間相干性。激光具有較強(qiáng)的相干性，但其成像的散斑噪聲嚴(yán)重。因此，一般將部分相干光源LED 發(fā)出的光經(jīng)微米孔徑調(diào)制，利用波陣面分割效應(yīng)，提高其相干性。

圖1 豬精子無透鏡衍射成像原理及裝置實(shí)物圖

1.2 裝置設(shè)計(jì)

所提出的豬精子三維運(yùn)動軌跡提取裝置，由一個精子無透鏡衍射成像采集裝置和內(nèi)置控制分析軟件的計(jì)算機(jī)組成。成像裝置如圖1（b）所示，光源和CMOS 成像模塊被分別固定于兩個微米級三維調(diào)節(jié)滑臺上，通過調(diào)節(jié)滑臺，確保光源、樣本、CMOS 感光區(qū)域自上而下精確位于一條鉛垂線上。采用650 nm 紅色單色燈珠作為光源，封裝在圓柱形套筒中，套筒下端中心處安裝有激光加工的直徑為50 μm 的微孔。采用型號為MT9F002（Micron Technology） CMOS 感光傳感器，該傳感器的像元尺寸為1.4×1.4 μm，成像區(qū)域尺寸為1/2.3-inch（4:3），分辨率460 8*328 8，其視場為400 倍率顯微鏡視場的數(shù)百倍。整個成像裝置密封于不透光的光學(xué)暗箱中。

2 材料制備

為便于研究，我們對豬鮮精液進(jìn)行了稀釋，制成豬鮮精稀釋溶液。選用健康種豬采集新鮮的精液，在37 ℃放置30 min 使其液化，從中取樣本并振蕩均勻，在完全液化為均勻水樣物后使用移液槍從精液表面緩慢吸取5 微升，吸取50 μL 精液加0.95 mL 水配比變?yōu)?∶20 稀釋溶液。精液密度過高時，將影響成像和分析。

3 無透鏡成像分析和處理

通過調(diào)節(jié)三維滑臺，對光源距離Z1、物像距離Z2進(jìn)行精確設(shè)置，在成像傳感器能夠被透射光均勻覆蓋時，成像效果較佳。在本研究中，最終確定較優(yōu)的光源距離為50 mm，物像距離為1 mm。所拍攝的圖像如圖2（a）所示。

圖2 無透鏡圖像重建和計(jì)數(shù)

3.1 重建算法

像平面上所獲得的圖案與生物微顆粒形態(tài)差別較大，需要對衍射圖案進(jìn)行重建，恢復(fù)物平面上的顆粒輪廓。重建的目標(biāo)是根據(jù)光的衍射過程，再現(xiàn)物光波的分布。基于光學(xué)標(biāo)量衍射理論[4]，物平面在平面波照射下，在像平面形成光場分布，該光場繼續(xù)向前傳播同樣的物像距離后，將得到實(shí)像和孿生像的疊加。本研究采用卷積法對進(jìn)行重建。在菲捏爾近似條件下，再現(xiàn)像的復(fù)振幅分布為：

其中，C（x，y）表示再現(xiàn)像的復(fù)振幅分布，I（x，y）表示全息圖的強(qiáng)度分布，再現(xiàn)距離為z1。利用瑞利- 索末菲衍射傳遞函數(shù)進(jìn)行重建，衍射集分轉(zhuǎn)化為傅里葉變換之間的卷積進(jìn)行積分?jǐn)?shù)值求解：

采用MATLAB 軟件對獲取的成像進(jìn)行重建和處理。重建時，需根據(jù)裝置實(shí)際情況設(shè)置相應(yīng)的光學(xué)參數(shù)。此外，在衍射計(jì)算中，傅里葉變換具有區(qū)域限制，重建時首先將整幅衍射圖像分割為200×200 像素的小塊，進(jìn)行小區(qū)域重建，然后再對重建圖像進(jìn)行拼接。重建結(jié)果如圖2（b）所示。

3.2 編號和計(jì)數(shù)

采用圖像處理算法進(jìn)行圖像分割，確定重建圖像精子頭部連通區(qū)域，進(jìn)一步處理，如圖2（d）所示，對視場內(nèi)每一個精子個體進(jìn)行編號和計(jì)數(shù)。

3.3 水平位置獲取

在對原始無透鏡成像進(jìn)行重建和圖像處理的基礎(chǔ)上，得到精子頭部所對應(yīng)的聯(lián)通區(qū)域，使用連通區(qū)域分析找到斑點(diǎn)的屬性，對每個斑點(diǎn)的屬性進(jìn)行遍歷，取目標(biāo)區(qū)域的輪廓質(zhì)心作為該個體的平面位置，記錄下其質(zhì)心坐標(biāo)，通過與實(shí)際空間距離進(jìn)行對應(yīng)換算，則可得到精子個體的平面坐標(biāo)，如圖3（a）所示。

圖3 豬精子個體平面坐標(biāo)和垂直高度提取

3.4 垂直高度獲取

在無透鏡成像中，處于不同物平面上的目標(biāo)都能夠形成衍射條紋，所不同的是他們具有不同的物像距離，如圖3（b），而物像距離正是重建計(jì)算時光場傳遞函數(shù)的重要參數(shù)。當(dāng)該參數(shù)設(shè)置為與實(shí)際一致時，重建結(jié)果中實(shí)像與虛像的對比度達(dá)到最大，表現(xiàn)為具有更尖銳的邊緣和更明顯的輪廓。利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)算法，通過建立聚焦度評價(jià)模型，則能夠鎖定樣本顆粒的真實(shí)物像距離。

據(jù)此，我們基于圖像梯度函數(shù)[5]設(shè)計(jì)了一個聚焦度評價(jià)模型。梯度函數(shù)常被用于評價(jià)邊緣清晰度，邊緣是像素值發(fā)生躍遷的地方，由于變化率大而導(dǎo)數(shù)值大。根據(jù)像素點(diǎn)相鄰點(diǎn)灰度加權(quán)差在邊緣處達(dá)到極值這一現(xiàn)象，引入Sobel 算子，Sober 算子包括兩組3×3矩陣，通過在水平和豎直兩個方向上分別進(jìn)行一階微分求導(dǎo)，得到圖像在水平和豎直方向的梯度：

其中Gx（m，n）為像素點(diǎn)水平反向的梯度值，Gy（m，n）為像素點(diǎn)豎直方向上的梯度值。重建圖像中邊緣更加尖銳會導(dǎo)致邊面與背景的差異較大而擁有更高的函數(shù)梯度值，像素點(diǎn)梯度值越大其越有可能是邊緣。第（m，n）個像素多對應(yīng)梯度值為：

在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)聚焦度評價(jià)函數(shù)以評價(jià)圖像的邊緣尖銳程度：

同時設(shè)計(jì)了一個自聚焦算法，通過對單個微顆粒重建過程中的物像距離參數(shù)不斷調(diào)整，以聚焦度評價(jià)函數(shù)作為依據(jù)，最終鎖定真實(shí)物像距離，如圖3（c）所示，最終獲得了同一視場下具有不同物像距離的微顆粒的三維分布情況。

3.5 運(yùn)動軌跡提取

精子運(yùn)動軌跡的提取過程如圖4（a）所示，通過對無透鏡衍射成像重建結(jié)果進(jìn)行圖像處理，可得到精子頭部聯(lián)通區(qū)域。根據(jù)成像視場，建立固定的三維坐標(biāo)體系。根據(jù)視頻流中的每一幀圖像，提取指定編號精子在該時刻下對應(yīng)x、y、z 軸三個坐標(biāo)，將相同編號的空間坐標(biāo)按照時間先后順序進(jìn)行連接，則可以描述出此編號豬精子在三維坐標(biāo)軸上對應(yīng)的運(yùn)動曲線，其中編號為13 的精子的最終獲取的運(yùn)動軌跡如圖4（b）所示。

圖4 豬精子三維軌跡提取方法及結(jié)果

4 結(jié)論

基于無透鏡成像技術(shù)的精子三維軌跡提取方法，其核心在于采集精子無透鏡衍射成像，然后進(jìn)行重建，輔以圖像處理等技術(shù)，得到精子個體三維坐標(biāo)。對高速攝影機(jī)拍攝的圖像序列進(jìn)行處理，生成運(yùn)動軌跡，以高幀率和高分辨率記錄精子的運(yùn)動過程。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步計(jì)算精子的三維運(yùn)動指標(biāo)以及考察其行為特征，彌補(bǔ)了CASA 計(jì)算機(jī)輔助分析方法的不足。同時，其在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些問題和挑戰(zhàn)。例如，精子的運(yùn)動速度和軌跡變化較快，對高速攝影和圖像處理算法的性能有較高的要求。精子的形態(tài)和大小差異不大，如何準(zhǔn)確識別和追蹤特定精子也是一個挑戰(zhàn)。針對以上問題，還需要持續(xù)改進(jìn)，隨著方法的進(jìn)一步優(yōu)化，其有望在精子質(zhì)量評估和生殖醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。