番茄疫霉根腐病菌拮抗細菌HP8-1的鑒定及生物防治潛力

王藝茹,潘培培,沈虎生,張林林,王潤東,何夢菡,申順善

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,河南 鄭州 450046)

近年來,隨著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,番茄種植面積不斷增加和連年種植,導致土壤病原菌的積累等連作障礙問題嚴重。番茄疫霉根腐病是由辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)和寄生疫霉(P.parasitica)等引起的一種毀滅性土傳病害,從苗期到成株期均可發(fā)生,主要危害根部,也可危害番茄其他部位,嚴重時引起整株枯死,在設施生產(chǎn)中發(fā)病嚴重,甚至毀種絕收,嚴重威脅番茄生產(chǎn)[1-2]。目前,生產(chǎn)上由于缺乏高抗品種,防治番茄疫霉根腐病主要采用化學藥劑,而長期使用化學藥劑易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,且對環(huán)境不友好,甚至對人畜造成安全隱患[3]。利用植物根際促生菌防治植物病害并促進植物生長,因其安全、環(huán)保、無殘留等特點,已受到廣泛關(guān)注[4-8]。西姆芽孢桿菌(Bacillussiamensis)FC12-05可顯著抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長和孢子萌發(fā),對番茄疫霉根腐病的盆栽防治效果顯著[9];貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)ZF50對辣椒疫霉菌有較好的抑菌效果,在盆栽試驗和田間試驗中均對番茄疫霉根腐病具有較好的防治效果,同時對番茄幼苗具有促生作用[10];貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)Y4-39對辣椒疫霉菌具有抑制效果,其發(fā)酵液對辣椒疫病的防治效果達67.78%[11]。但是,目前在生產(chǎn)上應用的防治植物疫病的微生物制劑還很欠缺,需要繼續(xù)篩選優(yōu)良生物防治資源,研發(fā)高效微生物制劑。本研究從河南省潢川縣吊蘭(Chlorophytumcomosum)根系分離篩選獲得一株具有較強拮抗活性的植物根際細菌HP8-1,探索其生物學功能和定殖能力,研究其對番茄疫霉根腐病的防治能力及其生物防治潛力,為番茄疫霉根腐病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物根際細菌HP8-1為從河南省橫川縣吊蘭根系分離篩選獲得,將HP8-1在含利福平的培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng),逐步提高利福平質(zhì)量濃度,最終得到穩(wěn)定抗利福平(100 mg·L-1)的菌株并保存?zhèn)溆?供試辣椒疫霉菌(P.capsici)是由河南農(nóng)業(yè)大學植物病害生物防治研究室分離、鑒定并保存。供試番茄品種‘粉都金冠王’為河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂(tryptic soy agar, TSA)培養(yǎng)基和V8瓊脂(vegetable juice agar,V8A)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方參考潘培培等[12]。

1.2 方法

1.2.1 HP8-1的鑒定 形態(tài)特征和生理生化特性主要參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13],16S rRNA序列同源性分析主要參考張婉菊等[14]的方法,擴增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對分析,并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 HP8-1菌懸液的配制 在TSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72 h后,刮取菌落用無菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液配制成108CFU·mL-1的菌懸液。

1.2.4 疫霉菌孢子懸浮液的配制 疫霉菌的孢子懸浮液的配制參照潘培培等[12]的方法,獲得104孢子·mL-1的游動孢子懸浮液。

1.2.5 HP8-1在番茄根際定殖量測定 采用稀釋涂布平板法測定番茄根際HP8-1的定殖量。選取2～3片真葉大小的健壯番茄苗移栽,移栽花盆直徑為 90 mm,將100 mL的HP8-1菌懸液灌注到番茄根際土壤,然后沿著花盆壁接種5 mL的疫霉菌孢子懸浮液,置于溫室培育。每個處理3個重復,每個重復18株。處理后第1天開始每隔3 d采集番茄根系和根際土壤測定HP8-1的定殖量。即:稱取清洗干凈的1 g番茄根系進行研磨,然后用無菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液稀釋獲得10-3～10-4根系稀釋液;稱取1 g番茄根際土壤,用無菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液稀釋獲得10-5～10-6根際土壤稀釋液,吸取0.1 mL根系和根際土壤稀釋液,分別均勻涂布于含100 mg·L-1利福平的TSA平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后調(diào)查菌落數(shù),推算出HP8-1的定殖量。

1.2.6 HP8-1對番茄疫霉根腐病的防治效果和對番茄的促生效果測定 HP8-1對番茄疫霉根腐病的防治效果和對番茄的促生效果測定采用盆栽試驗。HP8-1和疫霉菌處理方法同1.2.5,每個處理3個重復,每個重復18株。試驗設清水對照(CK)、HP8-1處理(HP8-1)、疫霉菌處理(Pc)和疫霉菌+HP8-1處理(Pc+HP8-1)。處理后第10天調(diào)查發(fā)病情況,計算病情指數(shù)和防治效果。調(diào)查番茄疫霉根腐病的病情分級標準參考KOZIK等[19]和毛愛軍等[20]方法并略作修改,0級為沒有癥狀;1級為根尖或側(cè)根出現(xiàn)輕微褐變,葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫;2級為根部中度褐變,變色不穿透髓,葉片不可恢復性萎蔫,下部葉片偶有脫落;3級為所有的根表面布滿棕色病變,髓變色,葉片明顯萎蔫或落葉明顯;4級為根系腐爛,地上部倒伏,植株死亡。另外,處理后在溫室培育第10天調(diào)查番茄生育指標,并采用分光光度法測定葉綠素含量,采用TTC法測定根系活力[21]。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×相應級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)×100

防治效果/%=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/ 對照病情指數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 和SPSS 26.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析,以最小顯著差數(shù)法(LSD)分析各處理的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HP8-1的鑒定和生物學功能

HP8-1在TSA培養(yǎng)基上形成米黃色、不規(guī)則形、半透明、邊緣不整齊的菌落(圖1)。HP8-1菌體為直桿狀,周生鞭毛,革蘭氏陽性,生長溫度為4～50 ℃,耐鹽度最高為NaCl質(zhì)量分數(shù)4%,能利用蔗糖、葡萄糖、甘油、麥芽糖和甘露醇,不能利用半乳糖和單寧酸,淀粉水解、硝酸鹽還原反應及V-P測定呈陽性,明膠液化、產(chǎn)H2S試驗呈陰性(表1)。HP8-1的16S rRNA基因擴增序列全長1 492 bp,利用NCBI進行BLAST比對結(jié)果,與多粘類芽孢桿菌對應16S rRNA序列同源性達到99%。采用MEGA軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹,與多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa(AB689757.1)聚在一個分支,支持率為100%(圖2)。綜上所述,結(jié)合形態(tài)學、生理生化特性及分子生物學鑒定結(jié)果, HP8-1為多粘類芽孢桿菌。HP8-1菌株的抑菌譜比較廣,對多種植物病原菌具有較強的抑菌活性(圖3)。另外,HP8-1菌株能夠分解有機磷、蛋白、淀粉和纖維素,具有產(chǎn)生嗜鐵素、葡聚糖酶和吲哚乙酸能力(圖4)。

表1 HP8-1的形態(tài)特征和生理生化特性Table 1 Morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of HP8-1

圖1 HP8-1的菌落形態(tài)Fig.1 HP8-1 colony morphology

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的HP8-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 HP8-1 phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

圖3 HP8-1對植物病原菌的抑菌活性Fig.3 Antifungal activity of HP8-1 against plant pathogens

圖4 HP8-1的生物學功能Fig.4 Biological functions of HP8-1

2.2 HP8-1在番茄根際定殖量

HP8-1在番茄根系及根際土壤均具有穩(wěn)定的定殖能力。在番茄根系,未接種疫霉菌條件下HP8-1在番茄根系的定殖量趨于減少,而在接種疫霉菌條件下,HP8-1在番茄根系的定殖量趨于增加,處理第1天,未接種疫霉菌的條件下HP8-1的定殖量為3.32×104CFU·g-1,高于接種疫霉菌條件下的HP8-1的定殖量,而到第10天,接種疫霉菌的條件下HP8-1的定殖量為7.48×104CFU·g-1,顯著高于未接種疫霉菌條件下的HP8-1的定殖量(圖5-A)。在番茄根際土壤,未接種疫霉菌和接種疫霉菌條件下HP8-1的定殖量均趨于增加,處理第1天和第4天,在未接種疫霉菌和接種疫霉菌條件下HP8-1的定殖量沒有差異,而到第7天和第10天,接種疫霉菌條件下HP8-1的定殖量分別為5.88×106和7.67×106CFU·g-1,顯著高于未接種疫霉菌條件下的HP8-1的定殖量(圖5-B)。可見,HP8-1在番茄根系和根際土壤中具有穩(wěn)定的定殖能力,在接種疫霉菌的條件下也能夠穩(wěn)定定殖在番茄根系和根際土壤。

A:根系;B:根際土壤。同組不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。A: Root; B: Rhizosphere soil. Different lowercase letters in same group indicate significant difference at p<0.05. The same as below.

2.3 HP8-1對番茄疫霉根腐病防治效果

HP8-1處理顯著抑制番茄疫霉根腐病的發(fā)生。接種疫霉菌處理(Pc)的番茄植株在接種疫霉菌后第6天開始表現(xiàn)下部葉片黃化脫落癥狀,第10天時葉片表現(xiàn)黃化萎蔫癥狀,根系有明顯腐爛,病情指數(shù)達到75.00;而HP8-1處理(Pc+HP8-1)的番茄植株,接種疫霉菌第6天沒有表現(xiàn)癥狀,第10天時根系部分褐變,病情指數(shù)為31.94,HP8-1處理對番茄疫霉根腐病的防治效果達到57.41%(表2,圖6)。

表2 HP8-1對番茄疫霉根腐病的防治效果Table 2 The control effect of HP8-1 against Phytophthora root rot of tomato

圖6 HP8-1對番茄疫霉根腐病的防治效果Fig.6 The control effect of HP8-1 againstPhytophthora root rot of tomato

2.4 HP8-1對番茄的促生效果

盆栽試驗結(jié)果表明,在接種疫霉菌和未接種疫霉菌條件下HP8-1處理均顯著促進番茄植株生長和根系發(fā)育。在未接種疫霉菌條件下,HP8-1處理(HP8-1)的番茄株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比清水處理(CK)提高2.56 cm、0.74 mm、2.66 g、1.01 g,番茄葉綠素含量比對照增加1.155 mg·g-1;

在接種疫霉菌的條件下,HP8-1處理(Pc+HP8-1)的番茄株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對照處理(Pc)提高3.66 cm、0.37 mm、2.33 g、0.95 g,番茄葉綠素含量比對照增加0.673 mg·g-1(表3,圖7)。在未接種疫霉菌條件下,HP8-1處理(HP8-1)的番茄根長、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和根體積比清水處理(CK)分別提高3.13 cm、0.64 g、0.09 g、0.73 cm3,根系活力比對照增加0.168 mg·g-1·h-1;在接種疫霉菌的條件下,HP8-1處理(Pc+HP8-1)的番茄根長、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和根體積比對照處理(Pc)分別提高3.3 cm、0.53 g、0.05 g、0.54 cm3,根系活力比對照增加0.154 mg·g-1·h-1(表4,圖8)。HP8-1對番茄整體促生效果見圖9。

表3 HP8-1對番茄植株生長的影響Table 3 Effect of HP8-1 on the growth of tomato

表4 HP8-1對番茄根系生長的影響Table 4 Effect of HP8-1 on root growth of tomato

圖7 HP8-1對番茄葉綠素含量的影響Fig.7 Effect of HP8-1 on chlorophyll content of tomato

圖8 HP8-1對番茄根系活力的影響Fig.8 Effect of HP8-1 on root activity of tomato

圖9 HP8-1對番茄的促生效果Fig.9 Growth-promoting effect of HP8-1 on tomato

3 結(jié)論與討論

多粘類芽孢桿菌屬于類芽孢桿菌屬,對環(huán)境無污染,對人畜無害,對植物不致病,兼具防病和促生作用,是具有潛力的生物防治資源[22-23]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),多粘類芽孢桿菌具有多種防病機制,對多種植物病害有較好的防治作用。如多粘類芽孢桿菌BRF-1菌懸液及無菌代謝產(chǎn)物對黃瓜和番茄枯萎病均具有防治效果[24];多粘類芽孢桿菌ZF197通過自身分泌抗菌活性物質(zhì)對白菜莖基腐病起到較好的防治效果[25];多粘類芽孢桿菌HAAS05可促進植物產(chǎn)生內(nèi)源激素,并在防御酶的共同作用下防治甘薯蔓割病[26];多粘類芽孢桿菌SeR8、BR20及SC09-21均可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、IAA和嗜鐵素,分解磷酸鈣,SeR8和BR20能防治小麥莖基腐病、小麥赤霉病和細菌性條斑病,SC09-21可促進辣椒生長并對辣椒疫病有顯著的防治作用[27-28]。本研究結(jié)合形態(tài)學、生理生化特性及分子生物學鑒定結(jié)果,HP8-1為多粘類芽孢桿菌,具有產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)葡聚糖酶、分解纖維素、分解蛋白、產(chǎn)IAA等生物學功能,該菌株對番茄疫霉根腐病具有明顯的防治效果,同時顯著促進番茄生長。另外,HP8-1的抑菌譜比較廣,對多種植物病原菌具有明顯的抑菌活性。綜上所述,HP8-1是很有潛力的生物防治資源,其具體的作用機制有待進一步探討。

生防菌在植物根際有效定殖是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵[29]。當生防菌在植物根際有效定殖后,可以提高植物對病原物的抗性并促進植物生長。如熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)PEF-5#18定殖于番茄根際土壤并擴展于番茄根系和莖內(nèi)組織,從而有效防控尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.radicislycopersic)的侵染并促進番茄植株生長[30];馬氏類芽孢桿菌(Paenibacillusmaysiensis)TL1在番茄果實中成功定殖,有效抑制由灰霉病菌引起的腐爛[31];蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)CLY07在南方紅豆杉根際能長期穩(wěn)定定殖,從而發(fā)揮極好的促生作用[32]。生防菌的根際定殖能力受到很多因素的影響,如生防菌本身的遺傳特性、土壤微生物、土壤理化性質(zhì)、根系分泌物等[33]。YUAN等[34]研究結(jié)果表明,接種植物病原菌能夠改變植株根系分泌物組分招募更多有益微生物,提高植物的抗病作用。本研究結(jié)果表明,HP8-1菌株在番茄根系和根際土壤均穩(wěn)定定殖,且在接種疫霉菌的條件下其定殖量增多,這可能是接種疫霉菌改變根系分泌物組分進而提高HP8-1的定殖量,它們之間的相關(guān)性有待于進一步分析。

綜上所述,HP8-1菌株作為植物根際促生細菌,對番茄疫霉根腐病有較好的防治效果和顯著促生作用,具有穩(wěn)定的定殖能力,具備較大的研發(fā)應用潛力,其生物防治機制和應用技術(shù)有待于進一步探索。