多組學(xué)質(zhì)譜分析技術(shù)在化學(xué)暴露組研究中的應(yīng)用

宋媛媛, 祁增華, 蔡宗葦*

(1. 香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)系,環(huán)境與生物分析國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 香港 999077;2. 廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

有研究表明,與遺傳變異等其他危險(xiǎn)因素相比,環(huán)境因素在人類慢性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著同等甚至更重要的作用。環(huán)境因素可以誘導(dǎo)人類基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組的變化[1,2]。2005年,Wild[3]首次提出了暴露組的概念,用于揭示人類疾病背后無法解釋的危險(xiǎn)因素。暴露組為科學(xué)家在研究環(huán)境疾病時(shí)提供了新的思路,從有針對(duì)性的、假設(shè)驅(qū)動(dòng)的模型走向不可知論模型[4,5]。許多研究領(lǐng)域都受益于這種觀念的轉(zhuǎn)變,包括環(huán)境流行病學(xué)、健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)以及機(jī)械生物學(xué)。已有大量報(bào)道[6-8]強(qiáng)調(diào)了暴露組表征在未來研究中的潛在益處。

暴露組的定義自誕生以來一直在演變。Wild[3]最初將其定義為“從出生開始的環(huán)境暴露的總和”;后來,他重新定義了暴露組的范圍,包括三大類非遺傳性暴露,即內(nèi)暴露(如代謝、腸道微生物組、炎癥)、特定外暴露(如環(huán)境污染物、飲食、職業(yè))和一般外暴露(如社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、教育和氣候)[9](圖1)。2014年,Miller和Jones[10]對(duì)暴露組的定義進(jìn)行了擴(kuò)展,納入了對(duì)這些暴露的生物反應(yīng)測(cè)量。暴露組的研究旨在實(shí)現(xiàn)兩個(gè)關(guān)鍵目標(biāo):(1)測(cè)量人類整個(gè)生命周期的累積暴露;(2)評(píng)估這些暴露與任何生物學(xué)變化之間的關(guān)聯(lián)或因果關(guān)系。根據(jù)暴露的具體類型,暴露組可以通過一系列技術(shù)來檢測(cè),包括遙感、問卷調(diào)查、地理信息系統(tǒng)、生物監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及質(zhì)譜多組學(xué)等[11]。由于暴露組的范圍非常廣,對(duì)其進(jìn)行全面綜述較為困難,本文將重點(diǎn)介紹從胚胎開始的整個(gè)環(huán)境化學(xué)暴露,即化學(xué)暴露組。本文對(duì)質(zhì)譜及質(zhì)譜多組學(xué)技術(shù)在化學(xué)暴露組檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,并介紹了本課題組在相關(guān)領(lǐng)域所取得的研究進(jìn)展。此外,我們討論了利用質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)暴露組檢測(cè)所面臨的挑戰(zhàn)。

圖 1 暴露組的組成及質(zhì)譜在暴露組檢測(cè)中的應(yīng)用Fig. 1 Composition of the exposome and application of mass spectrometry (MS) in exposome detection MSI: mass spectrometry imaging.

1 暴露組檢測(cè)方法

化學(xué)暴露組研究常用的策略包括“自上而下”和“自下而上”策略[1]?！白陨隙隆辈呗詫⒅攸c(diǎn)放在生物標(biāo)本中內(nèi)、外源化學(xué)物質(zhì)的分析檢測(cè)上,而“自下而上”策略則聚焦于環(huán)境介質(zhì)(如空氣、水、飲食、建筑環(huán)境)中化學(xué)物質(zhì)的鑒定分析。“自上而下”策略依賴于人類生物樣本的采集和檢測(cè),對(duì)生物樣本中內(nèi)源性物質(zhì)的改變進(jìn)行監(jiān)控,并同時(shí)調(diào)查受污染物脅迫后體內(nèi)和體外污染物的積累、代謝和降解轉(zhuǎn)化。通過使用非靶向組學(xué)技術(shù)來比較患病和健康受試者生物標(biāo)本中的暴露組,能夠發(fā)現(xiàn)潛在的因果特征,并根據(jù)結(jié)果設(shè)定后續(xù)研究的假設(shè),以確認(rèn)暴露組的化學(xué)特性,確定暴露源,并建立暴露-反應(yīng)曲線。“自下而上”策略首先是在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)受試者暴露的每個(gè)外部來源(如空氣、食物、水等)中所存在的所有化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行全面測(cè)量。在確定了分析物與健康結(jié)果有顯著關(guān)聯(lián)后,評(píng)估分析物在人體內(nèi)的吸收、代謝及生物學(xué)效應(yīng)。將“自上而下”策略與“自下而上”策略相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)暴露與生物反應(yīng)的內(nèi)部測(cè)量及外部環(huán)境測(cè)量之間的協(xié)同作用,從而確定暴露源和生物反應(yīng)來源,并更好地確定疾病與環(huán)境污染物之間的因果關(guān)系[12]。例如,生物流體中的小分子化學(xué)譜是將外部暴露與內(nèi)部劑量、生物反應(yīng)和疾病聯(lián)系起來的核心,這些信息可與接觸源(如空氣、水、飲食)聯(lián)系起來,以便全面了解環(huán)境接觸與健康或疾病結(jié)果之間的關(guān)系[12]。因此,對(duì)于暴露組的全面檢測(cè)尤為重要。隨著科技的進(jìn)步,對(duì)于一般外暴露的檢測(cè),可以采用調(diào)查問卷、衛(wèi)星遙感、公共數(shù)據(jù)庫、個(gè)人空氣采樣器及智能穿戴設(shè)備來實(shí)現(xiàn)[13,14](見表1)。在本文中我們將重點(diǎn)介紹以質(zhì)譜為手段的暴露組檢測(cè)方法,包括對(duì)特定外暴露(使用以質(zhì)譜為工具的化學(xué)技術(shù)直接測(cè)量外源性物質(zhì)及其代謝物在外部媒介及人體內(nèi)的含量及分布)和內(nèi)暴露(使用基于質(zhì)譜的高通量多組學(xué)方法檢測(cè)基因、蛋白質(zhì)及小分子代謝物的變化)的檢測(cè)。

表1 一般外暴露檢測(cè)的常用方法、具體手段和檢測(cè)指標(biāo)[13,14]

1.1 特定外暴露的檢測(cè)方法

特定外暴露可分為廣義的外暴露和狹義的外暴露。廣義的外暴露是指實(shí)際存在于環(huán)境中的有害物質(zhì)的量,通常我們提到的環(huán)境監(jiān)測(cè)即是對(duì)廣義外暴露的監(jiān)測(cè);而狹義的外暴露是指外部環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)的總量,即攝入量,通常是測(cè)定與人群接觸的環(huán)境介質(zhì)中某種環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的含量,再根據(jù)人體的接觸特征(如接觸時(shí)間、途徑等)估計(jì)個(gè)體的暴露水平[15]?；谫|(zhì)譜的分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè),是化學(xué)暴露組表征的主要化學(xué)方法[16]。由于質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性好和動(dòng)態(tài)范圍寬的優(yōu)勢(shì),其與液相色譜或氣相色譜等分離技術(shù)的結(jié)合已成為生物或環(huán)境樣品中化學(xué)物質(zhì)直接檢測(cè)的最常用方法。

1.1.1低分辨質(zhì)譜(LRMS)

LRMS被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確定量檢測(cè),其選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式允許對(duì)一系列目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析,具有靈敏度高和線性動(dòng)態(tài)范圍寬的優(yōu)點(diǎn);但LRMS只能在單位水平(～1 amu質(zhì)量窗口)達(dá)到m/z精度,無法區(qū)分分子質(zhì)量非常相近的化合物;此外,LRMS在全掃描模式下顯示出較低的靈敏度。以上兩個(gè)缺點(diǎn)限制了LRMS對(duì)未知物的檢測(cè)能力。因此,為了保證LRMS對(duì)化合物的識(shí)別,通常需要提供保留時(shí)間、至少兩個(gè)躍遷(前體離子的兩個(gè)產(chǎn)物離子)以及它們的強(qiáng)度比等信息[17]。

暴露組的傳統(tǒng)測(cè)量(針對(duì)性分析)嚴(yán)重依賴于LRMS對(duì)生物樣品中目標(biāo)外源性化合物或其代謝物的測(cè)量,該分析平臺(tái)通常能夠?yàn)楹哿克椒治鑫锏臏y(cè)量提供可驗(yàn)證和可靠的定量結(jié)果。生物標(biāo)本中的外源物含量通常較低[18],因此該分析平臺(tái)對(duì)于暴露組的研究具有關(guān)鍵價(jià)值。鑒于LRMS的可用性和成熟度,目前數(shù)據(jù)庫或健康調(diào)查中的生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)主要是通過LRMS獲得的。例如,由美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)發(fā)起的國家生物監(jiān)測(cè)計(jì)劃(NBP)正在利用LRMS定期測(cè)量大約300種已知的、對(duì)人類有毒的化學(xué)物質(zhì)。我們課題組[19,20]同樣利用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)2 823例孕婦尿液中的多種內(nèi)分泌干擾物(雙酚類、多羥基苯甲酸酯類和苯甲酮類)進(jìn)行了定量檢測(cè)。然而,當(dāng)涉及化學(xué)暴露組的檢測(cè)時(shí),基于LRMS的靶向分析有幾個(gè)局限性:(1)無法在一次運(yùn)行中覆蓋廣泛的化學(xué)物質(zhì);(2)對(duì)于在生物標(biāo)本中含量較高但不在目標(biāo)分析物清單中的化合物,其被遺漏的可能性較大;(3)可用于目標(biāo)分析物定量的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品有限;(4)某些前體離子只產(chǎn)生一個(gè)片段離子,從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的可能性較大;(5)由于基質(zhì)干擾,某些化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)會(huì)受到限制。

1.1.2高分辨質(zhì)譜(HRMS)

HRMS克服了LRMS的缺點(diǎn),在全掃描模式下可以提供高質(zhì)量的分辨率、精確的分子質(zhì)量和高的靈敏度[21],從而降低了對(duì)色譜分離的要求,提高了在復(fù)雜樣品中檢測(cè)低豐度化學(xué)物質(zhì)的能力。在實(shí)際應(yīng)用中,HRMS通常與其他質(zhì)量分析儀(包括四極桿飛行時(shí)間(Q-TOF)、離子阱飛行時(shí)間(IT-TOF)、靜電場軌道阱(Q Exactive)、線性離子阱軌道阱組合式質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap MS)和軌道阱三合一質(zhì)譜(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS))組合使用[22],這些混合質(zhì)量分析儀可以提供額外的優(yōu)勢(shì),如提高靈敏度和提供片段信息結(jié)構(gòu)等,并能夠應(yīng)用于暴露組的靶向分析、可疑篩查和未知篩查。

靶向分析 在靶向分析中,與LRMS相比,HRMS擁有更高的可信度和分析物覆蓋率。例如,在全掃描模式下檢測(cè)到目標(biāo)離子列表中的化合物,則將相應(yīng)地觸發(fā)MS/MS分析,這允許在同一次運(yùn)行中記錄大量化合物的全掃描產(chǎn)物離子譜圖,其檢測(cè)靈敏度也將高于大多數(shù)的LRMS。

圖 2 HRMS用于可疑篩查和未知篩查(以雙酚S葡糖苷酸為例)[27]Fig. 2 High-resolution mass spectrometry (HRMS) used for suspect and unknown screening (taking bisphenol S glucuronide as an example)[27]

可疑篩查 在擁有目標(biāo)物的特定化合物信息(分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理、化學(xué)性質(zhì))但缺乏商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,可以采用可疑篩查方法。前體離子的M+1和M+2同位素是確定化學(xué)式的關(guān)鍵,而二級(jí)質(zhì)譜信息則是闡明化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。許多研究使用Q-TOF MS或Orbitrap儀器進(jìn)行可疑篩查,成功鑒定了環(huán)境介質(zhì)(如天然水和廢水)中母體化合物的可疑轉(zhuǎn)化產(chǎn)物/代謝物[23,24]。例如,Wang等[25,26]利用UPLC-Q Exactive MS檢測(cè)了PM2.5中有機(jī)組分的具體分子組成,并鑒定了對(duì)苯二胺(PPD)類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物;Song等[27]利用UPLC-Q Exactive MS鑒定了雙酚S(雙酚A的替代物)的二相代謝產(chǎn)物(見圖2)。最近,這種可疑篩查技術(shù)也被用于人類樣本的研究。例如,Cappiello等[28]使用GC-TOF/MS檢測(cè)兒童腦組織中的環(huán)境污染物,發(fā)現(xiàn)兒童腦組織中存在五氯聯(lián)苯;另一項(xiàng)研究利用LC-Q-TOF/MS對(duì)母體血漿中的新型環(huán)境有機(jī)酸(EOAs)進(jìn)行鑒定,并發(fā)現(xiàn)了包括二苯甲酮-1和雙酚S在內(nèi)的共65種可疑EOAs[29]。以上這些化合物的現(xiàn)有資料可以幫助研究者獲取和識(shí)別可疑物質(zhì)。數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)模式通常用于可疑篩查,在對(duì)樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析后,根據(jù)設(shè)定的篩選條件篩選母離子,之后再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析;當(dāng)在樣品中發(fā)現(xiàn)可疑離子時(shí),可以使用化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理、化學(xué)性質(zhì)的衍生信息來識(shí)別和確認(rèn)化合物。

未知篩查 當(dāng)待測(cè)化合物不包含任何可用信息時(shí),可采用未知篩查方法。理論上,未知篩查是一種有前途的技術(shù),其可以測(cè)量樣品中無限數(shù)量的化合物,并且可以全面表征暴露組。未知篩查的工作流程類似于非靶向代謝組檢測(cè),具體包括:(1)根據(jù)全掃描質(zhì)譜圖對(duì)同一化合物的所有特征離子或特征峰進(jìn)行分組,并確定單同位素或中性分子質(zhì)量(需要注意的是,色譜圖中存在大量的離子峰,但并不是每個(gè)離子都代表一種單獨(dú)的化合物); (2)通過檢索數(shù)據(jù)庫(如PubChem和ChemSpider數(shù)據(jù)庫)中的同位素質(zhì)量或分子式來獲取候選化合物列表;(3)根據(jù)未知化合物的二級(jí)質(zhì)譜、保留時(shí)間和生化途徑等信息對(duì)候選化合物進(jìn)行排序。在大多數(shù)情況下,二級(jí)質(zhì)譜信息可以用于區(qū)分具有相同分子質(zhì)量的物質(zhì),其中有一些具有實(shí)驗(yàn)或計(jì)算機(jī)模擬二級(jí)質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)庫(如人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)和代謝物鏈接數(shù)據(jù)庫(METLIN))可供參考。在沒有參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下,可以通過定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)模型來獲得保留時(shí)間信息[30,31]。生化途徑和環(huán)境化學(xué)知識(shí)也可以用來縮小目標(biāo)化合物的篩查范圍。在代謝組學(xué)中,許多生物信息學(xué)工具使用生化途徑來篩選候選化合物,并對(duì)候選化合物進(jìn)行排序,如XCMS、xMSannotator和Mummichog等算法[32]。到目前為止,基于TOF儀器(主要是Q-TOF)的針對(duì)性分析、可疑篩查和未知篩查已被廣泛用于測(cè)量人類對(duì)各種化學(xué)品的暴露,包括持久性(如有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯醚)和非持久性(如藥物、農(nóng)藥、表面活性劑、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品)化學(xué)品的暴露[33]。一項(xiàng)研究[34]開發(fā)了一種基于LC-Q-TOF/MS的可疑篩查技術(shù),該技術(shù)擁有超過2 500種有毒化合物(包括非法藥物、治療藥物、農(nóng)藥和生物堿)的碰撞誘導(dǎo)解離精確質(zhì)譜庫。我們課題組[35,36]同樣采用未知篩查方法篩選到了PM2.5中的新型有機(jī)物,即三(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯(I168O)和硫代多環(huán)芳烴(PASHs)。

1.2 內(nèi)暴露的檢測(cè)方法

內(nèi)暴露是指從外界攝入的化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)留下的痕跡以及自身機(jī)體生物功能的改變,例如過敏反應(yīng)、小分子代謝紊亂、脂肪過氧化、炎癥效應(yīng)及氧化應(yīng)激等。內(nèi)暴露的測(cè)量可以提供在生物劑量下發(fā)生的急性生物反應(yīng)信息,也可以提供在幾年或幾十年前的環(huán)境應(yīng)激源引發(fā)的長期生理變化(即暴露記憶標(biāo)記)信息。以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的高通量多組學(xué)分析是研究內(nèi)暴露的有效途徑,并已在人群水平的大規(guī)模研究中得到了應(yīng)用[37]。除了代謝組學(xué),組學(xué)分析方法還包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基于質(zhì)譜成像的空間組學(xué)。在暴露框架內(nèi),這些方法可以在系統(tǒng)生物學(xué)水平上深入闡釋化學(xué)品暴露對(duì)人類健康影響的途徑。在組學(xué)水平上映射出的有效生物效應(yīng),已經(jīng)為人類的健康研究帶來了前所未有的信息,這些組學(xué)數(shù)據(jù)可用于產(chǎn)生新的假設(shè),以發(fā)現(xiàn)化學(xué)暴露的疾病病因(見圖3)。

1.2.1代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是HRMS得到廣泛應(yīng)用的一個(gè)研究領(lǐng)域。代謝組是指存在于一個(gè)生命系統(tǒng)中的所有低分子質(zhì)量代謝物的總和[38]?；贖RMS的非靶向代謝組學(xué)可以同時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì),包括內(nèi)源性代謝物、膳食化學(xué)物質(zhì)、微生物組衍生代謝物、環(huán)境化學(xué)物質(zhì)、商業(yè)產(chǎn)品和藥物等[39]。代謝組學(xué)提供了一種綜合測(cè)量方法,將暴露與內(nèi)劑量、生物效應(yīng)和疾病病理生物學(xué)聯(lián)系在了一起[13]?；趯?duì)樣品中所有物質(zhì)的檢測(cè),非靶向代謝組學(xué)極大地?cái)U(kuò)展了對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的監(jiān)測(cè)范圍,能夠用于檢測(cè)新的外源性代謝物以及鑒定未知污染物[40]。為了提供與質(zhì)譜特征相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)的確認(rèn)鑒定,通常需要對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行管理,這是一項(xiàng)關(guān)鍵的研究需求。盡管對(duì)化合物的精確鑒定仍然存在困難,但對(duì)代謝反應(yīng)的無偏見和全局表征能夠使我們產(chǎn)生新的假設(shè),以描述動(dòng)物模型[41]和人群[42,43]中化學(xué)暴露的毒理學(xué)機(jī)制。我們課題組[44,45]同樣利用代謝組學(xué)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大量不同污染物(大氣顆粒物、微塑料和內(nèi)分泌干擾物等)毒理效應(yīng)的評(píng)估;例如,利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn),除氧化損傷和炎癥外,代謝紊亂和能量失衡同樣是PM2.5產(chǎn)生毒性的重要機(jī)制。PM2.5不僅會(huì)引起呼吸系統(tǒng)和心血管疾病,還會(huì)引起肝臟[46]、脾臟[47]和腦部疾病及代謝紊亂[48],甚至?xí)鹂绱H毒性[49];同時(shí),PM2.5中所含有的有機(jī)磷阻燃劑(如磷酸三苯酯(TPHP))[50]、鄰苯二甲酸酯(DEHP)[51]、苯并噻唑[52]和苯并三唑[53]均會(huì)引起心臟毒性。Zhang等[54,55]則通過非靶向代謝組學(xué)同時(shí)檢測(cè)了正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在暴露三氯生和三氯卡班后,肝臟細(xì)胞內(nèi)三氯生和三氯卡班轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量以及受到干擾的小分子代謝物變化。綜上所述,由于代謝組學(xué)具有易于檢測(cè)、相對(duì)高通量和低成本等優(yōu)勢(shì),其已成為暴露組的關(guān)鍵分析平臺(tái)。

圖 3 多組學(xué)技術(shù)在內(nèi)暴露研究中的應(yīng)用Fig. 3 Application of multiomics techniques in internal exposure studies

1.2.2蛋白質(zhì)組學(xué)

通過測(cè)量蛋白質(zhì)含量變化來評(píng)估炎癥、氧化應(yīng)激和組織損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)方法已在臨床、流行病學(xué)、毒理學(xué)和藥理學(xué)中得到了很好的應(yīng)用。雖然基因表達(dá)可以提供對(duì)蛋白質(zhì)合成機(jī)制的深入研究,但對(duì)蛋白質(zhì)水平和翻譯后修飾的測(cè)量能夠提供更直接的生物功能變化信息。通常使用酶聯(lián)免疫吸附法來實(shí)現(xiàn)對(duì)有限數(shù)量蛋白質(zhì)的靶向測(cè)量,但新興的多路復(fù)用技術(shù)和基于磁珠富集的前處理方法能夠在生物材料消耗量更小的情況下完成對(duì)多種蛋白質(zhì)的測(cè)量[56]。在人群研究中,蛋白質(zhì)組學(xué)已應(yīng)用在暴露于柴油廢氣[57]和多環(huán)芳烴[58]的人體樣本檢測(cè)中,并發(fā)現(xiàn)了與免疫和炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)的改變。我們課題組同樣利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)外源污染物的毒性機(jī)理進(jìn)行了研究;例如,Ji等[59]和Huang等[60]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)探究了多溴聯(lián)苯醚(BDE47)和三氯生對(duì)小鼠大腦皮層及下丘腦功能的影響;Xie等[61]利用氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)探究了1-硝基芘對(duì)人肺細(xì)胞的作用機(jī)理;Zhao等[62]結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究了雙酚F對(duì)裸鼠肝臟和腎臟的毒性機(jī)制。由此可見,多重蛋白質(zhì)組學(xué)的持續(xù)發(fā)展在表征生物反應(yīng)方面具有相當(dāng)大的潛力。借助HRMS分析的非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠幫助科研人員更多地揭示蛋白質(zhì)和基因的功能,但傳統(tǒng)的非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在血清中低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)方面仍具有挑戰(zhàn)性[63]。

1.2.3表觀基因組學(xué)

基因表達(dá)變化是通過表觀遺傳變化來改變的,這些變化會(huì)改變基因組而不會(huì)改變潛在的DNA序列。表觀遺傳變化是通過DNA甲基化(或相關(guān)過程)或組蛋白修飾產(chǎn)生的,其會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的長期變化,這種變化可以在細(xì)胞分裂期間持續(xù)存在,并由后代遺傳。壓力源(包括化學(xué)物質(zhì)暴露、損傷、疾病和感染)可導(dǎo)致生物體產(chǎn)生明顯的表觀遺傳特征,這些特征在初始事件發(fā)生后很長時(shí)間內(nèi)仍然存在[64]。表觀基因組學(xué)是評(píng)估暴露史和適應(yīng)負(fù)荷的關(guān)鍵方法[65]。在人類細(xì)胞中,DNA的甲基化發(fā)生在胞嘧啶C5位置的CpG二核苷酸上,人類基因組中存在數(shù)千萬個(gè)CpG位點(diǎn),目前基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA大規(guī)模平行測(cè)序的高通量分析可提供高達(dá)850 000個(gè)CpG位點(diǎn)的測(cè)量。表觀基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了與化學(xué)暴露相關(guān)的不同甲基化模式,為了解生物反應(yīng)和疾病的潛在機(jī)制提供了見解[66,67]。雖然表觀基因組學(xué)研究主要集中在單一或易于表征的暴露,但在暴露組中表觀基因組學(xué)的應(yīng)用將提供對(duì)基因組和蛋白質(zhì)組之間相互作用的深入了解,并能夠表征由于環(huán)境暴露引起的長期和代際變化。通過監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)中組學(xué)水平上基因、蛋白質(zhì)和代謝物的變化,有助于了解環(huán)境對(duì)人類健康的影響。考慮到定量甲基化修飾的重要性,科研人員已經(jīng)開發(fā)出了多種定量方法,如測(cè)序法、比色法和色譜法;后來,質(zhì)譜法被證明是一種具有高精度和高靈敏度的DNA或RNA修飾鑒定方法;例如,Chang等[68]利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法評(píng)估了心肌梗死組織和外周血中甲基2-脫氧胞嘧啶(5mdC)、5-甲基胞嘧啶(5mrC)和6-甲基腺嘌呤(m6A)的水平。

1.2.4質(zhì)譜成像(MSI)

MSI是量化和定位數(shù)千種內(nèi)源性(代謝物、脂質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì))和外源性分子(元素、離子、藥物、環(huán)境污染物及其潛在代謝物)的關(guān)鍵分析技術(shù)[69],其對(duì)生理和病理問題的探索非常重要。具體來說,MSI技術(shù)無需標(biāo)記和染色即可檢測(cè)組織切片的任意子區(qū)域,從而獲得目標(biāo)物的空間定位[70]。MS和MSI技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于污染物和藥物的代謝監(jiān)測(cè)、臨床診斷及治療過程中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和神經(jīng)退行性疾病分子機(jī)制的研究。Vallianatou等[71]結(jié)合MSI技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)模型發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)信號(hào)通路、線粒體功能和神經(jīng)傳遞中與年齡相關(guān)的代謝異質(zhì)性。近年來,我們課題組也將MSI技術(shù)應(yīng)用到了暴露組研究中;例如,Lin等[72]利用基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜成像儀(MALDI-TOF MSI)實(shí)現(xiàn)了雙酚S在小鼠脾和心臟等不同組織中的原位成像;Zhao等[49,73,74]將MSI技術(shù)與分子生物學(xué)手段相結(jié)合,研究了裸鼠經(jīng)雙酚S暴露后腎臟和腫瘤的脂質(zhì)代謝紊亂以及孕鼠經(jīng)PM2.5暴露后的跨代際毒性;Xie等[75,76]則發(fā)現(xiàn)了不同污染物對(duì)3D細(xì)胞球中的小分子和脂質(zhì)代謝異常問題。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組學(xué)

基因表達(dá)是將遺傳密碼轉(zhuǎn)錄為RNA的過程,而RNA用于啟動(dòng)和指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。RNA調(diào)控是通過一系列復(fù)雜的相互作用實(shí)現(xiàn)的,這些相互作用控制著蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量。因此,由暴露引起的基因表達(dá)變化可以反映下游蛋白質(zhì)組和代謝組功能的潛在變化,從而在暴露和表型之間提供直接聯(lián)系。化學(xué)物質(zhì)暴露與人類和動(dòng)物模型中不同的基因表達(dá)譜有關(guān)[77]。暴露于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析一般不使用質(zhì)譜,而主要依賴于DNA微陣列雜交技術(shù)[78,79]。最近,新一代測(cè)序(如RNA-Seq)得到了廣泛應(yīng)用,其可以測(cè)量信使RNA、微小RNA、小干擾RNA和長鏈非編碼RNA,為研究與化學(xué)暴露相關(guān)的基因表達(dá)變化提供了新的手段[80]。數(shù)據(jù)庫(如比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCD))能夠提供關(guān)于化學(xué)、基因、表型和疾病關(guān)系的精選信息[81],極大地增強(qiáng)了在暴露組框架內(nèi)基因組學(xué)的生物學(xué)解釋功能。

通過對(duì)生物反應(yīng)的組學(xué)水平數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估,可以為研究環(huán)境對(duì)人類健康的影響提供新的途徑。通過整合代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀基因組學(xué)和空間組學(xué)的反應(yīng)測(cè)量,可以系統(tǒng)揭示暴露對(duì)關(guān)鍵生化過程的影響機(jī)理。綜合生物反應(yīng)模式,將毒理學(xué)、藥理學(xué)與分子和環(huán)境流行病學(xué)相結(jié)合,可以為化學(xué)毒理學(xué)機(jī)制的研究提供新的范式。

2 多組學(xué)質(zhì)譜分析技術(shù)在暴露組研究中的挑戰(zhàn)

暴露組的復(fù)雜性和異質(zhì)性及其在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)變化給暴露組的測(cè)量帶來了巨大的挑戰(zhàn)[9],目前最全面的方法是構(gòu)建大樣本量的和長期隨訪的流行病學(xué)隊(duì)列研究。歐盟的EXPOsOMICS和HELIX項(xiàng)目以及美國的CHEAR項(xiàng)目是暴露組研究方面的典型案例[5,82,83]。然而,通常這類研究既昂貴又費(fèi)力,迫切需要其他方法來降低暴露組研究的成本。近年來,科研人員憑借回顧性時(shí)間暴露分析技術(shù),從牙齒和毛發(fā)等新基質(zhì)中篩選出生物標(biāo)志物,并用于評(píng)估暴露的時(shí)間和組成[84,85],該技術(shù)為研究人類歷史暴露提供了有效方法。另一個(gè)挑戰(zhàn)是,沒有一種分析技術(shù)可以在一個(gè)樣本中檢測(cè)到所有的化學(xué)暴露組,因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)在物理、化學(xué)性質(zhì)方面存在著明顯差異,包括質(zhì)量、極性、豐度、親脂性和解離常數(shù)(pKa)等[86];即使使用相同的技術(shù),不同的樣品處理方法和參數(shù)設(shè)置也會(huì)顯著影響結(jié)果。為了測(cè)量盡可能多的化學(xué)物質(zhì),應(yīng)仔細(xì)分配樣品并做適當(dāng)處理,以適應(yīng)不同的分析技術(shù),但這會(huì)提高實(shí)驗(yàn)成本。

生物樣品中的外源性物質(zhì)及其代謝物通常處于微量水平,比內(nèi)源性代謝物低幾個(gè)數(shù)量級(jí)[18],這對(duì)分析儀器的靈敏度也提出了更高的要求,同時(shí)這也是基于質(zhì)譜的分析平臺(tái)在化學(xué)暴露組測(cè)量中越來越受歡迎的原因之一。低分辨質(zhì)譜受儀器噪聲的影響較大,此外,在高分辨質(zhì)譜中所觀察到的同位素模式通常無法用于外源性物質(zhì)檢測(cè),這增加了外源性物質(zhì)鑒定的難度。最近,新加坡的一個(gè)研究小組[87]用同位素標(biāo)記了具有共同官能團(tuán)的外源性生物標(biāo)志物(包括酚羥基、羧基和伯胺),與其他基于質(zhì)譜的方法相比,該方法對(duì)外源性物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度提高了2～1 184倍。也有報(bào)道顯示,增加重復(fù)注射次數(shù)有助于提高高分辨代謝組學(xué)中低豐度化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)的可靠性[88]。最近的一項(xiàng)研究建議將離子遷移率光譜法整合到基于質(zhì)譜的暴露檢測(cè)中,這可以提供更大的整體測(cè)量動(dòng)態(tài)范圍,從而檢測(cè)到在其他常規(guī)方法中未能檢測(cè)到的低豐度分子[89]。

針對(duì)未知物質(zhì)識(shí)別和鑒定的數(shù)據(jù)分析方法開發(fā)也是基于質(zhì)譜的化學(xué)暴露組研究所面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前,沒有一種可用的化學(xué)計(jì)量學(xué)和生物信息學(xué)工具能夠成功地將所有離子或特征峰正確地分組和對(duì)齊,并且每種算法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。此外,盡管化合物數(shù)據(jù)庫的覆蓋范圍每年都在增加,但它們?nèi)匀贿h(yuǎn)遠(yuǎn)落后于可用的化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量。例如,PubChem中存在超過6 000萬種化學(xué)物質(zhì),然而,數(shù)據(jù)庫中僅有大約20 000個(gè)分子的220 000個(gè)二級(jí)質(zhì)譜圖可以訪問[90]。

3 結(jié)論

暴露組研究為識(shí)別影響各種疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵非遺傳因素提供了一個(gè)很好的機(jī)會(huì)。本文討論了化學(xué)暴露組研究中的常用策略,并對(duì)現(xiàn)有的化學(xué)暴露組研究方法(主要是基于質(zhì)譜的方法)進(jìn)行了綜述。隨著技術(shù)的進(jìn)步和暴露組本體論的建立,我們有望揭示非遺傳因素在人類疾病發(fā)病機(jī)制中的作用,并獲得更多令人興奮的發(fā)現(xiàn)。