蛋白質聚集在白內障發(fā)病中的作用研究進展△

郭昭興 萬修華

白內障是目前全球首要致盲眼病[1],其特點是晶狀體混濁引起的進行性視力下降。一般認為,晶狀體蛋白質聚集是白內障發(fā)病中的一個重要過程。晶狀體蛋白分為水溶性和非水溶性兩種,水溶性蛋白含量降低和非水溶性蛋白含量升高均可導致白內障。

生理狀態(tài)下的晶狀體是具有屈光功能的透明組織,由大量晶狀體蛋白規(guī)律排布構成。晶狀體蛋白分為 α-、β-和γ-晶狀體蛋白 3 個亞家族。其中α-晶狀體蛋白屬于小熱休克蛋白,具有分子伴侶功能,可輔助其他晶狀體蛋白正確折疊從而抑制蛋白質聚集[2]。β-和γ-晶狀體蛋白是晶狀體主要的結構蛋白,主要維持晶狀體的結構和功能[3-4]。

蛋白質聚集的原因并非一個新興的研究方向,其中涉及的具體機制目前仍未完全清楚[5]。近些年隨著液相色譜-質譜法、核磁共振波譜法、分子動力學模擬等技術的廣泛應用,有關蛋白質聚集的研究不斷深入。此外,研究人員針對抗蛋白質聚集途徑篩選出了有效的化合物,這為白內障藥物研發(fā)提供了新的思路?；蛲蛔?、異構化與共價修飾、化合物和離子作用、蛋白質相互作用均是蛋白質聚集發(fā)生的原因。本文圍繞上述四點對蛋白質聚集在白內障發(fā)病中的作用研究進展進行綜述,以期為后續(xù)研究提供資料和參考。

1 基因突變

白內障致病突變在先天性白內障的發(fā)病過程中扮演著重要角色[6],其致病機制具有較高的研究價值。Qi等[7]研究發(fā)現(xiàn),S228P突變可分離βB1-晶狀體蛋白C端結構域中的兩個高度保守的相互作用環(huán),從而將疏水核心與天然βB1-晶狀體蛋白中的溶劑隔離開來。重新折疊的S228P突變蛋白具有更少的堆積結構和未淬滅的色氨酸熒光團,同時有著更多的疏水基團暴露。在生理溫度下S228P突變蛋白容易聚集,降低了βB1-晶狀體蛋白對βA3-晶狀體蛋白的保護作用。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)兩個先天性白內障致病突變W59C和W151C均可以破壞保守的色氨酸殘基從而極大降低βB2-晶狀體蛋白的溶解度及對熱和鹽酸胍的穩(wěn)定性。Zhu等[9]通過光譜實驗也得出類似的結果,G75V突變體有更多的色氨酸熒光團和疏水性暴露基團。突變體γS-晶狀體蛋白的變異體更容易受到熱處理、鹽酸胍和酸性條件的影響。除上述幾個實驗外,Xu等[10]發(fā)現(xiàn)的S31W和R145W突變、Fu等[11]發(fā)現(xiàn)的L45P和Y46D突變、Ren等[12]發(fā)現(xiàn)的S93R突變經過光譜實驗和動態(tài)分子模擬論證,幾乎都能改變β/γ-晶狀體蛋白中的四個保守的色氨酸殘基暴露基團,進而影響β/γ-晶狀體蛋白結構,造成晶狀體蛋白質聚集,該途徑可能與先天性白內障的發(fā)病息息相關。

2 異構化與共價修飾

2.1 天冬氨酸異構化

α-晶狀體蛋白由αA-和αB-兩個亞基組成,在晶狀體蛋白合成過程中發(fā)揮分子伴侶功能,可輔助晶狀體蛋白正確折疊。此前有研究發(fā)現(xiàn),老年人αB-晶狀體蛋白中的天冬氨酸(Asp)存在異常量的異構化(Asp96)。為探究Asp96異構化的影響,Takata等[13]將αB-晶狀體蛋白的殘基93-103合成肽鏈,其中L-α-Asp被L-β-Asp、D-α-Asp或D-β-Asp取代,生物學測定結果顯示,Asp96的異構化可以改變肽鏈的局部結構及其對酶消化的穩(wěn)定性。Fujii等[14]則利用液相色譜-質譜法測定αA-晶狀體蛋白中Asp58、Asp91/92和Asp151異構體的比例,結果表明,非水溶性物異構體比例最多,高分子量蛋白質聚集體次之,α-晶狀體蛋白最少。因此,Asp在α-晶狀體蛋白中的異構化可能是蛋白質聚集的觸發(fā)因素,會導致白內障的形成。

2.2 谷氨酰胺脫酰胺

除Asp異構化以外,αA-晶狀體蛋白中谷氨酰胺(Glu)的脫酰胺反應在年齡相關性白內障患者晶狀體中也很常見。這種修飾在白內障患者晶狀體不溶性部分中非常普遍,可能與白內障形成相關。Ray等[15]測定了Glu147脫酰胺對αA-晶狀體在體外伴侶能力的影響。Glu147脫酰胺的αA-晶狀體蛋白的伴侶能力略有降低,其中心α-晶狀體結構域的整體結構略有破壞,顯示出形成低聚物的趨勢。由于αA-晶狀體蛋白占比最多,即使是很小的功能喪失也可能導致晶狀體混濁。

2.3 天冬酰胺脫酰胺

Forsythe等[16]研究發(fā)現(xiàn),從老化晶狀體分離的不溶性蛋白質內的γS-晶狀體蛋白存在天冬酰胺(Asn)高度脫酰胺(Asn14和Asn76)現(xiàn)象。這些位點位于N端結構域的表面,研究人員采用Asp殘基替換Asn,可產生重組人γS-脫酰胺突變體。對比發(fā)現(xiàn),突變體的光散射增加,熱誘導變性過程中出現(xiàn)蛋白質聚集。Vetter等[17]則通過在N14、N76和N143三處位點模擬脫酰胺過程,并通過動態(tài)光散射,化學和熱變性,氫-氘交換和對二硫鍵交聯(lián)的敏感性評估Asn脫酰胺對γS-晶狀體蛋白生理特性的影響,結果顯示,少量脫酰胺突變體迅速聚集成大型光散射物質,它們是造成晶狀體光散射的主要成分;在鹽酸胍或高溫下,脫酰胺可加速蛋白質的展開和聚集,并增加蛋白質對氧化的敏感性。此外,三重突變體更加不穩(wěn)定,說明脫酰胺的影響具有累積性。

2.4 甲基乙二醛修飾

αA-晶狀體蛋白中的G98R突變與年齡相關性白內障的發(fā)生同樣存在聯(lián)系。研究表明,突變蛋白結構改變,穩(wěn)定性降低,寡聚體大小增加,伴侶樣活性喪失以及對蛋白水解的易感性升高可能是白內障形成的促成因素[12]。Santhoshkumar等[18]研究發(fā)現(xiàn),用低濃度(50 μmol·L-1)的甲基乙二醛(MGO)修飾蛋白質,可以提高αAG98突變體的穩(wěn)定性和伴侶活性。將αAG98R蛋白(1 g·L-1)在無菌條件下于37 ℃孵育30 d會導致突變蛋白沉淀,而用50 μmol·L-1MGO修飾的突變蛋白則能保持穩(wěn)定的可溶性和透明性。上述結果提示低濃度MGO修飾在穩(wěn)定突變伴侶蛋白方面具有潛在作用。

2.5 泛素化修飾

年齡相關性白內障主要與紫外線-B(UVB)誘導的蛋白質氧化損傷關系密切。錯配修復蛋白3(MSH3)作為錯配修復家族的關鍵成員,主要維持基因組穩(wěn)定性。然而,目前人們對MSH3的功能及維持MSH3蛋白質平衡的機制仍然未知。Chen等[19]最新研究發(fā)現(xiàn),暴露在UVB下,年齡相關性白內障標本和SRA01/04細胞中MSH3的蛋白表達水平降低。MSH3的異位表達顯著阻礙了UVB誘導的細胞凋亡,而MSH3水平下降則會促進細胞凋亡。蛋白質半衰期測定顯示,UVB照射可通過泛素化和降解作用加速降低MSH3水平。此外,研究人員發(fā)現(xiàn),E3泛素連接酶合成滑膜蛋白(SYVN1)可與MSH3相互作用,促進后者泛素化和降解。綜上,年齡相關性白內障的發(fā)病機制可能涉及SYVN1介導的MSH3泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑,針對SYVN1的干預措施很有可能成為年齡相關性白內障的潛在治療方向。另有研究[20]表明,E3泛素連接酶RING指蛋白157(RNF157)會與腫瘤抗原p53相互作用從而調控晶狀體上皮細胞的凋亡。RNF157可引起p53的泛素化和降解,降低RNF157表達則會上調p53的表達進而促進晶狀體上皮細胞凋亡。由此看來,對RNF157表達的調節(jié)可以作為白內障潛在的治療策略。

3 化合物和離子作用

目前,針對白內障的治療仍以手術為主,探尋有效的白內障藥物始終是科研人員關注的課題。2015年Zhao等[21]報道,在體外和細胞轉染實驗中利用羊毛甾醇處理均可降低預制蛋白質聚集體的含量。進一步實驗表明,通過羊毛甾醇治療可以提高離體兔眼白內障晶狀體和狗在體白內障晶狀體的透明度。這一研究在白內障藥物研發(fā)方面具有重要意義,相關研究結果為白內障藥物研制開辟出了新的思路。Makley等[22]圍繞甾醇類物質進一步開展研究,通過熱穩(wěn)定性測定,該團隊鑒定了一類可結合α-晶狀體蛋白并在體外逆轉其聚集的分子。人們通過差式掃描熒光法發(fā)現(xiàn)25羥基膽固醇可以改善R49C和R120G突變所致遺傳性白內障小鼠模型中晶狀體的透明度。更為重要的是,它還部分恢復了老年小鼠在體晶狀體和人離體晶狀體中的蛋白質溶解度,這提示25羥基膽固醇可作為藥物應用于年齡相關性白內障的預防和治療。Chen等[23]在上述兩項研究的基礎上對羊毛甾醇和25羥基膽固醇的有效性進行了離體組織定量研究。實驗材料選取了通過手術分離出的人白內障患者晶狀體中的蛋白質聚集體。用兩種化合物分別處理樣品,二者均對蛋白質聚集體的溶解有效,且有效性與白內障嚴重程度相關。另有研究[24]表明,人眼晶狀體代謝物肌醇作為天然的化學伴侶可抑制晶狀體蛋白的聚集。代謝組學證據(jù)表明,與年齡匹配的對照組相比,人類白內障患者晶狀體的肌醇被嚴重耗盡。通過維持人眼晶狀體內正常肌醇水平可預防或延緩晶狀體混濁。

金屬離子的暴露則是白內障形成過程中的另一個危險因素。Quintanar等[25]發(fā)現(xiàn)Cu2+和Zn2+離子都可誘導人γD-晶狀體蛋白快速非淀粉樣聚集,形成高分子量的輕散射聚集體。Cu2+離子可降低人γD-晶狀體蛋白的熱穩(wěn)定性,促進二硫鍵橋接二聚體的形成。Ramkumar等[26]也通過實驗得到了類似的結果。值得注意的是,這種金屬離子誘導的聚集都強烈依賴于溫度,并且可被αB-晶狀體蛋白抑制。Domínguez-Calva等[27]將金屬-晶狀體蛋白相互作用的研究擴展到重金屬離子,如二價鉛、鎘和汞。使用濁度測定、電子顯微鏡、電子吸收和圓二色光譜評估這些重金屬離子在三種同源人γ-晶狀體蛋白的非淀粉樣蛋白質聚集中的作用。結果表明,Hg2+離子可以誘導人γC-和γS-晶狀體蛋白的非淀粉樣蛋白質聚集,但不能誘導γD-晶狀體蛋白質聚集。汞誘導蛋白質聚集的機制包括直接的金屬-蛋白質相互作用、熱穩(wěn)定性喪失、蛋白質N端結構域的部分展開以及二硫鍵橋接二聚體的形成。Ramirez-Bello等[28]評估了Cu2+和Zn2+離子對βA1-蛋白(酸性蛋白代表)和βB2-蛋白(堿性蛋白代表)聚集的影響,結果表明,Cu2+離子誘導βA1-晶狀體蛋白的構象變化很小,導致高分子量的輕散射聚集體形成,而Zn2+離子對βB2-晶狀體蛋白更具侵略性且可誘導更大的構象變化。

4 蛋白質相互作用

晶狀體內含有高濃度的晶狀體蛋白,因此其也是最擁擠的生物環(huán)境之一。此前許多研究已經探討了αB-晶狀體蛋白在體外稀釋條件下的結構和功能,但擁擠對這些方面的影響尚不清楚。Grosas等[29]以多糖Ficoll400和牛γ-晶狀體蛋白為擁擠劑,采用生物物理方法,研究了αB-晶狀體蛋白在擁擠環(huán)境下的結構和伴侶能力,結果表明,αB-晶狀體蛋白會出現(xiàn)展開,形成低聚狀態(tài),其熱穩(wěn)定性和伴侶能力降低。然而,αA-晶狀體蛋白的存在可以穩(wěn)定αB-晶狀體蛋白的聚集。這初步揭示了晶狀體蛋白質相互作用對于蛋白質聚集造成的影響。Schmid等[30]則通過對來自不同小鼠品系α-、β-或γ-晶狀體蛋白的點突變進行分析發(fā)現(xiàn),這些晶狀體蛋白在體外是不穩(wěn)定的。它們的含量在晶狀體中大大降低,且它們的非水溶性部分不會積聚。相反,所有其他晶狀體蛋白,包括α-晶狀體蛋白都發(fā)生了沉淀。在突變晶狀體中觀察到的晶狀體蛋白質組成和空間組織的變化表明,晶狀體蛋白質組的不平衡和晶狀體蛋白相互作用的改變是白內障形成的基礎,并非突變晶狀體蛋白本身具有的聚集傾向,分子伴侶池的耗盡最終會導致晶狀體混濁。該團隊創(chuàng)新性地從蛋白質組的角度出發(fā)對蛋白質聚集進行了解釋,晶狀體蛋白間的相互作用成為研究蛋白質聚集過程中的一個獨立因素。

5 結束語

應用基因測序技術和其他分子生物學技術,人們將先天性白內障所涉及的基因突變位點及突變對晶狀體蛋白結構造成的影響逐漸揭示清楚。目前,多種共價修飾在年齡相關性白內障發(fā)生過程中的意義已被闡明,通過抗蛋白質聚集途徑逆轉白內障的化合物也已成功篩選。值得注意的是,僅從基因突變的角度出發(fā)去解釋先天性白內障的發(fā)病機制是遠遠不夠的?；虻谋磉_涉及多個步驟,任一步均有可能造成蛋白質的錯誤折疊和聚集。眼科科研人員同時也應關注后續(xù)基因轉錄及晶狀體蛋白翻譯過程,系統(tǒng)評估先天性白內障可能的致病環(huán)節(jié)。白內障成藥的潛在化合物雖已找到,但目前并沒有形成具體的藥物制劑,更沒有開展臨床試驗。針對年齡相關性白內障可能的干預位點目前也沒有更進一步的研究驗證其可行性。希望未來能有更多白內障藥物進入臨床應用,早日將實驗室獲得的研究成果應用于臨床實踐。誠然,通過抗蛋白質聚集這一途徑預防或治療白內障還需要克服很多困難。不過隨著研究的深入,蛋白質聚集涉及的分子機制會更加完善,未來白內障的預防和治療將會得到更全面的擴展。