磺胺二甲嘧啶廢水處理系統(tǒng)中Exiguobacterium sp.H-1的分離及其環(huán)境適應(yīng)特性

陳田，王壯，蘆夢(mèng)瑤，陳研，周佳*，屈建航*，潘婧詩(shī)，羅宇

1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院

2.河南工業(yè)大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院

近年來(lái)，隨著全球人口的快速增長(zhǎng)和對(duì)動(dòng)物蛋白食品需求的不斷增加，抗生素的消耗量在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自然環(huán)境中殘留的磺胺類抗生素濃度接近 mg/L 級(jí)別[1]?；前范奏奏ぃ╯ulfamethazine，SMZ）是一種短效性磺胺類抗菌藥物，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域應(yīng)用較多[2]，動(dòng)物無(wú)法完全消化吸收的SMZ 會(huì)通過(guò)糞便和尿液釋放出來(lái)，以原藥或代謝產(chǎn)物進(jìn)入土壤和水環(huán)境[3-4]，影響環(huán)境中微生物和動(dòng)植物的生長(zhǎng)，產(chǎn)生抗生素耐藥性以及抗性基因，并通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移與病原體結(jié)合，導(dǎo)致更高的致病風(fēng)險(xiǎn)[5]。SMZ 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以自然降解，這一類新興有機(jī)污染物引起的抗生素污染問(wèn)題亟待解決[6]。

目前，SMZ 的去除主要采用物化處理工藝，如吸附法、催化氧化法和電化學(xué)氧化法等[7]，雖然這些方法降解率相對(duì)較高，但其處理負(fù)荷有限，二次耗能、成本較高，且會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染[8]。而生物法主要通過(guò)微生物的生命活動(dòng)，將難以分解的抗生素（如SMZ）分解為小分子物質(zhì)[9]，其中SMZ 降解菌的分離和獲得是生物法處理SMZ 的重要環(huán)節(jié)，但目前關(guān)于降解SMZ 的功能微生物的研究較為缺乏，亟須開(kāi)發(fā)SMZ 高效降解菌的優(yōu)質(zhì)菌種資源。車琦[10]從地下水中分離出以磺胺二甲嘧啶為唯一碳源的菌株WQD2，當(dāng)SMZ 濃度為5 mg/L 時(shí)，降解率可達(dá)80.80%±0.6%；當(dāng)SMZ 濃度升至10 mg/L 時(shí)，降解率只有9.83%±0.2%。Pan 等[11]從抗生素制藥廠的活性污泥中篩選分離出一株SMZ 降解菌Geobacillus thermoleovoransS-07，通過(guò)外加酵母提取物和葡萄糖條件下，24 h 內(nèi)對(duì)10 mg/L 的SMZ 的降解率為95%。Huang 等[12]從處理SMZ 廢水的厭氧序批式反應(yīng)器的活性污泥中篩選到一株SMZ 降解菌S-3，當(dāng)溫度為30 ℃、pH 為7 時(shí)，菌株S-3 對(duì)5 mg/L 磺胺二甲嘧啶的降解率為33.40%。這些研究結(jié)果表明微生物在去除廢水中的SMZ 方面具有潛在價(jià)值，但SMZ 降解菌在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中易受到各種環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致其對(duì)SMZ 修復(fù)效果欠佳，因此SMZ 降解菌的環(huán)境適應(yīng)性研究尤為重要。本研究以處理SMZ 廢水的兩級(jí)生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)的污泥為原料，分離出一株磺胺二甲嘧啶降解菌，探究SMZ 濃度、接種量、pH 和溫度各因素對(duì)該菌株降解SMZ過(guò)程中環(huán)境適應(yīng)性的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化該菌株降解SMZ 的最佳環(huán)境條件，基于液相色譜/質(zhì)譜法（LC/MS）推測(cè)其生物降解SMZ 的途徑，以期為SMZ污染水體的環(huán)境修復(fù)提供微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源

活性污泥樣品來(lái)源于兩級(jí)生物接觸氧化反應(yīng)器處理磺胺二甲嘧啶廢水系統(tǒng)運(yùn)行第80 天時(shí)填料上的活性污泥。

1.1.2 主要試劑

磺胺二甲嘧啶廢水：無(wú)水乙酸鈉1.15 g/L，氯化銨0.34 g/L，磷酸二氫鉀0.10 g/L，以磺胺二甲嘧啶作為降解目標(biāo)，微量元素1.00 mL/L（1.50 g/L FeCl3·6H2O，0.15 g/L H3BO3，0.03 g/L CuSO4·5H2O，0.03 g/L KI，0.12 g/L MnCl4·H2O，0.06 g/L NaMoO4·2H2O，0.12 g/L ZnSO4·7H2O，0.15 g/L CoCl2·6H2O），去離子水1 L，7×104Pa 滅菌20 min。

1 000 mg/L 磺胺二甲嘧啶溶液[13]：稱取0.10 g磺胺二甲嘧啶，加入到乙腈中，定容至100 mL，避光保存，使用時(shí)采用無(wú)菌的0.22 μm 濾膜推濾滅菌。

LB（肉湯）培養(yǎng)基[14]在7×104Pa 下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

稱取10.00 g 活性污泥于90.00 mL 含1.00 mg/L 磺胺二甲嘧啶廢水中，于28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5 h，靜置1 h。吸取上層懸浮液1.00 mL 于9.00 mL 的無(wú)菌水中，依次梯度稀釋成10?9～10?1的菌懸液。每個(gè)梯度各取0.50 mL 涂布于含1.00 mg/L 磺胺二甲嘧啶的LB 固體培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。利用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化，直至出現(xiàn)單菌落，將其命為H-1。根據(jù)《細(xì)菌分子遺傳學(xué)分類鑒定法》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)其進(jìn)行生理生化測(cè)定[15-16]。

1.2.2 細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將篩選到的菌株H-1 用堿裂解法制備DNA 模板，采用細(xì)菌通用引物1492R（5′-CTACGGCTACCT TGTTACGA-3′）和27F（5′-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[17]，得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)上海生物工程股份有限公司測(cè)序，通過(guò)BLAST 程序?qū)y(cè)序所得16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3Exiguobacteriumsp.H-1 的生長(zhǎng)和降解特性

1.2.3.1 生長(zhǎng)曲線和降解曲線的測(cè)定

挑取適量的H-1 菌落接種至200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)。以未接菌的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔4 h 取7 mL 測(cè)定其OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，設(shè)置3 組平行試驗(yàn)。

挑取適量H-1 菌落于LB 液體培養(yǎng)基，在28℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h 后，8 000 r/min 離心8 min，棄上清，無(wú)菌水重懸3 次后，調(diào)節(jié)OD600至1.0。以4%接種量接種到5 mg/L 磺胺二甲嘧啶廢水中，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)，以4 h 間隔周期取樣，8 000 r/min 離心8 min，取上清液，0.22 μm 濾膜推濾，高效液相色譜法測(cè)定SMZ 濃度，繪制降解曲線[18]。

高效液相色譜法采用Agilent ZORBAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，進(jìn)樣量為20.00 μL，流速為1.00 mL/min，流動(dòng)相a 相為乙腈，b 相為純凈水。流動(dòng)相洗脫梯度：0～2.00 min 40% a 相，2.00～4.00 min 30% a 相，4.00～6.00 min 25% a 相。

1.2.3.2 單因素試驗(yàn)

挑取適量H-1 菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基，在28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h 后，8 000 r/min 離心8 min，棄去上清，無(wú)菌水重懸3 次后調(diào)OD600至1.0。接種到磺胺二甲嘧啶廢水中，在28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)48 h 后，8 000 r/min 離心8 min，高效液相色譜法測(cè)定上清液中SMZ 濃度，分別考察不同初始SMZ 濃度、接種量、pH、溫度等條件下，菌株H-1 對(duì)磺胺二甲嘧啶降解率的影響。

將上述OD600為1.0 的H-1 菌懸液分別接種于SMZ 濃度為1、3、5、7、9 mg/L 的SMZ 廢水中；將上述OD600為1.0 的H-1 菌懸液分別以接種量為2%、4%、6%、8%、10%和12%（體積比）接種于SMZ 廢水中；分別將SMZ 廢水的pH 調(diào)節(jié)至5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0；分別在20、24、28、32 和36 ℃條件下振蕩培養(yǎng)。

1.2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（Design Expert 12.0 軟件），對(duì)菌株H-1 的接種量、SMZ 廢水的pH、培養(yǎng)溫度進(jìn)行編碼，以SMZ 降解率為響應(yīng)值，選用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

挑取適量H-1 菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h，然后以8 000 r/min 離心8 min，棄去上清液，無(wú)菌水重懸后調(diào)OD600至1.0，接種到5 mg/L SMZ 廢水中，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，8 000 r/min 離心8 min，0.22 μm 濾膜推濾，高效液相色譜法測(cè)定SMZ 濃度。利用響應(yīng)曲面模型對(duì)菌株H-1在SMZ 水體環(huán)境中適應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳條件并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.3.4 SMZ 降解中間產(chǎn)物

挑取適量H-1 菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h，然后8 000 r/min 離心8 min，棄去上清液，無(wú)菌水重懸后調(diào)節(jié)OD600至1.0，以上述響應(yīng)面優(yōu)化出的最佳降解條件接種到5 mg/L SMZ廢水中，分別在第0、48 小時(shí)取樣，進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。質(zhì)譜條件：采用Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，進(jìn)樣量為20.00 μL，流速為1.00 mL/min，流動(dòng)相a 相為乙腈，b 相為純凈水。流動(dòng)相洗脫梯度：0～2.00 min 40% a 相，2.00～4.00 min 30% a 相，4.00～6.00 min 25% a 相。電噴霧離子源（ESI）選用正離子掃描模式，電壓為3.0 kV，離子源溫度為 150 ℃，溶劑氣體流量為 650 L/h，溶解氣溫度為 450 ℃，反吹氣流量為150 L/h，對(duì)不同的質(zhì)核比（m/z）進(jìn)行掃描測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌H-1 的形態(tài)及部分生理生化特性

菌株H-1 在LB 培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)1～2 d后，菌落呈圓形、黃色，菌體呈長(zhǎng)桿狀（圖1），長(zhǎng)1.27 μm，寬0.6 μm，好氧菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，其生理生化特征[19]見(jiàn)表2。

圖1 菌株H-1 掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of strain H-1

表2 菌株H-1 的部分生理生化特性Table 2 Partial physiological and biochemical properties of strain H-1

2.2 菌株H-1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

菌株H-1 的16S rRNA 序列長(zhǎng)度為1 470 bp。在NCBI 中進(jìn)行同源性分析（BLAST 軟件），采用neighbor-joining 法（MEGA 7.0 軟件）構(gòu)建菌株H-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖2）表明，菌株H-1 與Exiguobacteriumprofundum的相似性高達(dá)99.52%，并與其在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上親緣關(guān)系最近。綜合菌株H-1的菌落和菌體形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果，鑒定菌株H-1 為Exiguobacterium屬。

圖2 菌株H-1 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain H-1 based on 16S rRNA gene sequence

2.3 菌株H-1 的生長(zhǎng)曲線和降解曲線

菌株H-1 的生長(zhǎng)和降解曲線如圖3 所示。由圖3可見(jiàn)，菌株H-1 生長(zhǎng)迅速，維持36 h 之后進(jìn)入穩(wěn)定期，衰亡期相對(duì)較長(zhǎng)。隨著菌株H-1 的生長(zhǎng)，對(duì)SMZ的降解率逐漸增加，在48 h菌株H-1 降解SMZ 的效果最佳，其降解趨勢(shì)與生長(zhǎng)趨勢(shì)正相關(guān)。

圖3 菌株H-1 的生長(zhǎng)和降解曲線Fig.3 Growth and degradation curve of strain H-1

2.4 環(huán)境因素對(duì)菌株H-1 降解SMZ 廢水效果的影響

選取SMZ 濃度、H-1 接種量、pH 和培養(yǎng)溫度考察環(huán)境因素對(duì)菌株H-1 降解SMZ 效果的影響。由圖4（a）可見(jiàn)，當(dāng)SMZ 濃度為1 mg/L 時(shí)，菌株H-1 對(duì)其降解率為9.49%；當(dāng)SMZ 濃度為5 mg/L 時(shí)，其降解率最高，為10.45%；當(dāng)SMZ 濃度高于5 mg/L 時(shí)，菌株H-1 降解SMZ 的效果逐漸減弱，說(shuō)明持續(xù)升高的SMZ 濃度對(duì)其生長(zhǎng)的毒性作用增強(qiáng)，導(dǎo)致其活性降低，因此選擇5 mg/LSMZ 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。圖4（b）反映出當(dāng)菌株H-1 的接種量為4%時(shí)，其對(duì)SMZ 降解效果最佳，降解率為9.47%。隨著接種量的逐漸增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，產(chǎn)生代謝廢物增多，從而導(dǎo)致SMZ 降解率下降。由圖4（c）可知，SMZ 廢水的初始pH 過(guò)小或過(guò)大都會(huì)極大地抑制菌株H-1 的降解效果，中性（pH=7）時(shí)其降解效果較好。圖4（d）中菌株H-1 對(duì)SMZ 的降解率隨著溫度的升高而升高，在28 ℃時(shí)達(dá)到最高，之后隨溫度的升高逐漸降低，說(shuō)明溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞酶活性，致使其降解SMZ 效果逐漸減弱。

圖4 初始SMZ 濃度、接種量、pH 和溫度對(duì)菌株H-1 環(huán)境適應(yīng)性的影響Fig.4 Effect of initial sulfamethazine concentration,inoculum,pH and temperature on the environmental adaptation of strain H-1

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化后的環(huán)境因素對(duì)菌株H-1 降解SMZ 廢水效果的影響

選取接種量、pH 和溫度這3 個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化菌株H-1 降解SMZ 廢水過(guò)程中的環(huán)境適應(yīng)條件。通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)擬合，得到SMZ 降解率（Y）對(duì)接種量（A）、pH（B）、溫度（C）3 個(gè)因素的二次項(xiàng)回歸方程：

對(duì)模型進(jìn)行回歸分析的結(jié)果表明（表3），該模型的顯著性檢驗(yàn)P=0.024 2（＜0.05），二次方程擬合差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以用來(lái)預(yù)測(cè)各因素對(duì)菌株H-1 降解SMZ 廢水過(guò)程中的環(huán)境適應(yīng)性，3 個(gè)因素的影響順序依次為pH＞溫度＞接種量。

表3 菌株H-1 的回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation for strain H-1

圖5 是pH 和接種量對(duì)菌株H-1 降解SMZ 廢水過(guò)程中環(huán)境適應(yīng)性的影響。隨著pH 和接種量的改變，H-1 對(duì)SMZ 降解率呈現(xiàn)拋物線形式。當(dāng)pH 為7.0，接種量為4%時(shí)，菌株H-1 對(duì)SMZ 的降解效果最好。圖6 表明隨著溫度和接種量的變化，菌株H-1在SMZ 廢水中的環(huán)境適應(yīng)性變化不明顯。圖7 中隨著pH 和培養(yǎng)溫度的增加，菌株H-1 對(duì)SMZ 的降解率呈先增加后減小的趨勢(shì)。

圖5 接種量與pH 對(duì)菌株H-1 在SMZ 廢水中環(huán)境適應(yīng)性的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour plots of inoculum and pH on the environmental adaptation of strain H-1 in SMZ wastewater

圖6 接種量與溫度對(duì)菌株H-1 在SMZ 廢水中環(huán)境適應(yīng)性的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour plots of inoculum and temperature on the environmental adaptation of strain H-1 in SMZ wastewater

根據(jù)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)，當(dāng)接種量、SMZ 廢水pH 和培養(yǎng)溫度分別為4.40%、7.21 和28.86 ℃時(shí)，菌株H-1 對(duì)SMZ 的降解率最高，為12.72%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此最佳條件下，實(shí)際SMZ 降解率為10.54%，與預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明該模型具有可靠性。

2.6 菌株H-1 降解SMZ 的途徑

根據(jù)產(chǎn)物的組成推測(cè)菌株H-1 降解SMZ 的路徑如圖8 所示，主要有6 種中間產(chǎn)物，分別為N-（4,6-二甲基嘧啶-2 基）-1,4-二苯胺（產(chǎn)物1，m/z=215.14）、苯胺（產(chǎn)物2，m/z=94.07）、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶（產(chǎn)物3，m/z=124.08）、4,6-二甲基嘧啶（產(chǎn)物4，m/z=109.08）、2-苯-4,6-二甲基嘧啶（產(chǎn)物5，m/z=185.12）和2-苯基-1,2-二氫嘧 啶（產(chǎn)物6，m/z=159.97）。菌株H-1 降解SMZ 的路徑1 為磺胺二甲基嘧啶先脫去SO2，生成嘧啶環(huán)和苯胺環(huán)，經(jīng)過(guò)耦合生成N-（4,6-二甲基嘧啶-2 基）-1,4-二苯胺（m/z=215.14），然后C—N 鍵斷開(kāi)生成2-氨基-4,6-二甲基嘧啶（m/z=124.08）與苯胺（m/z=94.07），而產(chǎn)物3 進(jìn)一步脫氨生成4,6-二甲基嘧啶（m/z=109.08）；路徑2 為產(chǎn)物1 進(jìn)行脫氨反應(yīng)，生成2-苯-4,6-二甲基嘧啶（m/z=185.12），隨后去甲基化生成產(chǎn)物6（2-苯基-1,2-二氫嘧啶，m/z=159.97）。

圖8 菌株H-1 可能的降解SMZ 途徑Fig.8 Possible SMZ degradation pathways of strain H-1

3 討論

抗生素生產(chǎn)量及使用量的迅速增加，加快了抗生素抗性細(xì)菌（ABR）和抗生素抗性基因（ARGs）的擴(kuò)散和傳播，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了威脅[20-21]。作為典型的磺胺類抗生素，SMZ 廢水的處理已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。以往的研究曾采用Fe2+催化過(guò)碳酸鈉降解水體中的SMZ，當(dāng)Fe2+∶過(guò)碳酸鈉∶SMZ 的最佳物質(zhì)量比為15∶10∶1 時(shí)，對(duì)0.02 mmol/L SMZ 的降解率為84%，但該技術(shù)藥耗大，且污泥產(chǎn)量極大，需二次耗能[22]。隨著環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，采用低碳和清潔的生物法處理SMZ 廢水更具應(yīng)用前景[23]。如Yang 等[24]采用活性污泥法處理5 μg/L SMZ 時(shí)，SMZ 的降解率達(dá)到24%。Huang等[12]利用厭氧序批式反應(yīng)器處理SMZ 廢水，當(dāng)污泥停留時(shí)間延長(zhǎng)，由5 d 到25 d 時(shí)，SMZ（27～39 μg/L）的降解率由45%提高到80%。課題組前期利用兩級(jí)生物接觸氧化反應(yīng)器處理SMZ 廢水時(shí)，當(dāng)進(jìn)水SMZ 濃度為0.1～1 mg/L 時(shí)，SMZ 的降解率在90%以上；當(dāng)SMZ 濃度增至3 mg/L 時(shí)，SMZ 的平均降解率降至39.36%，同時(shí)利用宏基因組測(cè)序技術(shù)揭示了系統(tǒng)內(nèi)微生物群落組成和變化，挖掘了與SMZ 降解相關(guān)的核心微生物。本研究進(jìn)一步從該系統(tǒng)中分離篩選到一株SMZ 降解菌H-1。當(dāng)接種量、pH 和培養(yǎng)溫度分別為4.40%、7.21 和28.86 ℃時(shí)，對(duì)5 mg/L SMZ 的降解率為10.54%。當(dāng)接種量大于4%時(shí)，縮短了H-1 的延滯期，但可供H-1 生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，代謝負(fù)荷增加導(dǎo)致了SMZ 降解率的下降[25]。在最適溫度28 ℃時(shí)，H-1對(duì)SMZ 的降解率最高，隨著溫度的進(jìn)一步增加可能影響了與SMZ 降解有關(guān)酶的合成，導(dǎo)致其降解率逐漸降低。

目前，已報(bào)道的可降解SMZ 的細(xì)菌大多是從活性污泥和污水中分離出來(lái)的，主要?dú)w屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、斯氏假單胞菌（Pseudomonas skrjabini）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）和類節(jié)桿菌（Paenarthrobacte）等（表4）。雖然Exiguobacteriumsp.H-1 的降解能力有限，48 h 內(nèi)對(duì)5 mg/L SMZ 的降解率為10.54%，低于Achromobactersp.S-3 在24 h 時(shí)對(duì)5 mg/L SMZ 的降解率（33.40%），但其降解率仍高于Fusarium solani在168 h 時(shí)對(duì)1.5 mg/L SMZ 的降解率（18.53%）[26]，以及S.oneidensisMR-1 在120 h 對(duì)2 mg/L SMZ 的降解率（23.00%）[27]，這可能是因?yàn)榫闔-1 是在3 mg/L SMZ 濃度下的兩級(jí)生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)活性污泥中分離篩選得到的，其原始生境中SMZ 濃度有限，菌株H-1 無(wú)法完全展現(xiàn)其降解能力。但是菌株H-1 對(duì)鹽分的適應(yīng)性較強(qiáng)（10%NaCl），可見(jiàn)該菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)。此外，菌株H-1 降解SMZ 的路徑1 為磺胺二甲基嘧啶先脫去SO2，生成嘧啶環(huán)和苯胺環(huán)，經(jīng)過(guò)耦合生成N-(4,6-二甲基嘧啶-2 基)-1,4-二苯胺，然后C—N 鍵斷開(kāi)生成2-氨基-4,6-二甲基嘧啶與苯胺，這與張珈瑜等[9]分離篩選的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）J2 和李晨鈺[28]分離篩選的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）降解SMZ 的途徑一致，其在生物降解、氧化降解、光降解方法中均檢測(cè)到N-(4,6-二甲基嘧啶-2 基)-1,4-二苯胺的存在，這表明脫硫途徑是SMZ 降解的基礎(chǔ)代謝途徑。但與這2 株菌所不同的是菌株H-1 降解SMZ 的路徑2 為N-（4,6-二甲基嘧啶-2 基）-1,4 二苯胺進(jìn)行脫氨反應(yīng)，生成2-苯-4,6-二甲基嘧啶，隨后去甲基化生成產(chǎn)物6（m/z=159.97），產(chǎn)物5 的MS/MS 片段在m/z=108、78 處，可能代表4,6-二甲基嘧啶和苯環(huán)[29]，這可能是微小桿菌屬（Exiguobacteriumsp.）在SMZ 降解過(guò)程中的獨(dú)特之處。

表4 已報(bào)道的部分磺胺二甲嘧啶降解菌的降解效果Table 4 Degradation effect of some reported sulfamethazine degrading bacteria

微小桿菌屬分布范圍廣，具有較高的環(huán)境適應(yīng)性，與其余已報(bào)道的SMZ 降解菌相比，微小桿菌屬具有多種代謝途徑以適應(yīng)多種多樣的生境。趙芮等[30]發(fā)現(xiàn)微小桿菌具有多種能量代謝途徑相關(guān)基因，這可能是其能夠適應(yīng)極端復(fù)雜環(huán)境的機(jī)制之一。在開(kāi)發(fā)微生物菌劑應(yīng)用到環(huán)境的過(guò)程中，對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)能力尤為重要，而微小桿菌屬的可適性能成為其開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)。

其次，微小桿菌屬具有分解有機(jī)污染物、修復(fù)重金屬污染、處理污水的功能。以往的研究從長(zhǎng)期使用阿特拉津作除草劑的玉米田土樣中分離出Exiguobacteriumsp.BTAH1，在126 h 內(nèi)能使1 000 mg/L 的阿特拉津完全礦化[31]；從耐六價(jià)鉻細(xì)菌的富集培養(yǎng)物中篩選出Exiguobacteriumsp.S1 在8 h 內(nèi)對(duì)8 000 μg/mL Cr6+降解率可達(dá)91%[32]；從魚產(chǎn)品加工廠排污廢水中篩選得到Exiguobacterium oxidotoleransT-2-2，其細(xì)胞提取物中的過(guò)氧化氫酶活性比大腸桿菌細(xì)胞提取物高567 倍，且能在NaCl 濃度為0～12%條件下生長(zhǎng)，是一種具有較強(qiáng)的H2O2分解能力的嗜鹽菌[33]。但迄今為止，鮮見(jiàn)微小桿菌屬降解SMZ 的相關(guān)報(bào)道。介于菌株H-1 降解SMZ 的能力仍有提升空間，在后續(xù)的研究中可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：1）利用花生殼、玉米秸稈、甘蔗皮制備生物炭，通過(guò)固定化技術(shù)提高菌株H-1 對(duì)SMZ 的降解率，而以往的研究也表明以生物炭和海藻酸鈉為載體通過(guò)吸附-包埋技術(shù)將SMZ 降解菌H38 制成固定化菌，在25℃、150 r/min 的條件下，60 h 之內(nèi)固定化菌H38 可將10 mg/L 的SMZ 完全去除，而游離菌的降解率僅為75.2%[34]。基于前期獲得的H-1 適應(yīng)SMZ 的各種環(huán)境條件，提高其降解率。2）在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)菌株H-1 進(jìn)行紫外誘變，以期得到理想的可應(yīng)用于環(huán)境的SMZ 降解菌株。3）SMZ 作為一種抗生素，其本身對(duì)菌株H-1 的生長(zhǎng)具有抑制作用，而復(fù)蘇促進(jìn)因子（Rpf）不僅能增加惡劣環(huán)境條件下的低代謝活性細(xì)胞的代謝活性，促進(jìn)其生長(zhǎng)，而且還能刺激正常菌體的生長(zhǎng)，其對(duì)菌株TG9 的生長(zhǎng)及降解聯(lián)苯（BP）和多氟聯(lián)苯具有促進(jìn)作用[35]。因此，后續(xù)也將利用藤黃微球菌提取制備Rpf，探究Rpf 對(duì)磺胺二甲嘧啶降解菌H-1 的促進(jìn)效果。

綜上所述，微小桿菌屬可廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、生物修復(fù)等領(lǐng)域，也可利用基因工程改造技術(shù)提高其基因表達(dá)量，增加活性物質(zhì)的產(chǎn)量，其應(yīng)用前景廣闊，但是目前關(guān)于Exiguobacteriumsp.H-1 對(duì)SMZ的降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用等方面仍需進(jìn)一步研究，這對(duì)環(huán)境中磺胺類廢水的污染治理具有現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

（1）從處理SMZ 廢水的活性污泥中分離篩選出一株SMZ 降解菌H-1，結(jié)合菌株H-1 的形態(tài)特征、16S rRNA 與系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明該菌歸屬微小桿菌屬（Exiguobacterium），其菌落呈圓形、黃色，菌體呈長(zhǎng)桿狀，為革蘭氏染色陽(yáng)性，在0～10% NaCl 的廣泛范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性。

（2）通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了初始SMZ 濃度、接種量、pH 和溫度對(duì)Exiguobacteriumsp.H-1 降解SMZ 效果的影響，結(jié)果表明，接種量、pH 和溫度對(duì)菌株H-1 降解SMZ 的影響較大；采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化菌株H-1 降解SMZ 廢水的最佳條件，得出當(dāng)接種量為4.40%、pH 為7.21、培養(yǎng)溫度為28.86 ℃時(shí)，對(duì)5 mg/L SMZ 的降解率為10.54%。

（3）利用LC-MS 技術(shù)分析菌株H-1 降解SMZ 的獨(dú)特之處是能夠?qū)MZ 脫去SO2，生成嘧啶環(huán)和苯胺環(huán)，經(jīng)過(guò)耦合生成N-（4,6-二甲基嘧啶-2 基）-1,4-二苯胺，然后進(jìn)行脫氨反應(yīng)，生成2-苯-4,6-二甲基嘧啶，隨后去甲基化生成產(chǎn)物6（m/z=159.97），為SMZ 污染的生物修復(fù)提供了優(yōu)良的耐鹽能力強(qiáng)的微生物資源。