基于環(huán)境DNA 的長(zhǎng)江中華鱘分布特征探究

周權(quán)，杜浩，王潔，邵蕓，閆振廣*

1.環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所

中華鱘(Acipenser sinensis)是我國(guó)一級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物，屬于鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser)。中華鱘作為古老而珍稀的軟骨硬磷魚(yú)類(lèi)，在生物進(jìn)化、地球變遷等方面具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值，而且中華鱘的歷史比現(xiàn)代長(zhǎng)江還要悠久，可謂地質(zhì)年代的活化石，有人將中華鱘比作“水中大熊貓”，是長(zhǎng)江流域重要的鱘類(lèi)旗艦物種[1]。中華鱘曾廣泛分布于我國(guó)黃海北部海洋島至海南省萬(wàn)寧市近海，甚至遠(yuǎn)至海外[2]，但是近年來(lái)中華鱘資源量急劇下降，1988 年中華鱘被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，并進(jìn)入瀕危物種名單[3]，2010 年，中華鱘被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）發(fā)布的物種紅色目錄列為CR（極危）等級(jí)物種。中華鱘的瀕危情況受自身種群質(zhì)量、人類(lèi)活動(dòng)及環(huán)境變化等多方面的綜合影響[4]，人類(lèi)活動(dòng)和環(huán)境變化對(duì)中華鱘的脅迫更呈現(xiàn)出了多樣性與復(fù)雜性[5]。中華鱘屬于底棲性魚(yú)類(lèi)，有洄游習(xí)性，在淡水中出生，在海洋中成長(zhǎng)發(fā)育至性成熟后，洄游到淡水河流中產(chǎn)卵，繁殖期后再返回海洋。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江中華鱘種群接近性成熟的個(gè)體在6—8 月進(jìn)入長(zhǎng)江口進(jìn)行溯河生殖洄游，于次年10—11 月到達(dá)長(zhǎng)江上游和葛洲壩下產(chǎn)卵場(chǎng)[6]。在空間分布上，中華鱘在洄游過(guò)程中多分布于江水的中下層，沿主河槽遷移，偶爾有向上層或露出水面遷移的現(xiàn)象[7]。

監(jiān)測(cè)中華鱘的方法多樣，可以利用聲吶、水下攝影、食卵魚(yú)解剖等方法觀(guān)測(cè)中華鱘的具體個(gè)體，還可以通過(guò)地理信息系統(tǒng)（GIS）和遙感系統(tǒng)（RS）調(diào)查中華鱘[8]，也可以利用放流標(biāo)記追蹤技術(shù)、衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究放流的中華鱘分布情況[9]。目前中華鱘監(jiān)測(cè)常用的方法為分子檢測(cè)方法，包括基于核苷酸微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）[10]、利用微衛(wèi)星DNA 探索中華鱘繁殖行為[11]，以及通過(guò)線(xiàn)粒體DNA 研究中華鱘遺傳多樣性[12]。但是這些方法都需要觀(guān)測(cè)到中華鱘個(gè)體，甚至取得其組織樣品，取樣困難并且調(diào)查成本高昂。如何在流域尺度上開(kāi)展中華鱘監(jiān)測(cè)仍然是難題[13]。

長(zhǎng)江大保護(hù)中關(guān)于禁漁的要求使得對(duì)長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)進(jìn)行無(wú)損監(jiān)測(cè)更加迫切，近年來(lái)，環(huán)境DNA（eDNA）技術(shù)越來(lái)越多地被用于生物多樣性研究[14]。eDNA檢測(cè)是一種對(duì)生物體無(wú)損的環(huán)境友好型監(jiān)測(cè)技術(shù)，eDNA 是指來(lái)自目標(biāo)物種的生物外遺傳物質(zhì)，它允許在不直接觀(guān)察或捕獲整個(gè)生物體的情況下，通過(guò)生物體脫落的細(xì)胞和糞便等釋放到環(huán)境中的DNA 檢測(cè)到物種的存在或最近的存在[15]，這些DNA 可能是來(lái)自各種來(lái)源的線(xiàn)粒體或核DNA，包括脫落的部分生物體組織、尿液、黏液、卵子或精子等，可以以細(xì)胞和細(xì)胞外形式存在[16]。因此eDNA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)，還可以提高監(jiān)測(cè)特異性和敏感性，這些特點(diǎn)都十分適合研究長(zhǎng)江中華鱘。eDNA 技術(shù)于2008 年首次用于追蹤美國(guó)牛蛙的分布，此后被廣泛用于檢測(cè)兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)[17]。與傳統(tǒng)的人工形態(tài)學(xué)調(diào)查方法相比，eDNA 方法具有省時(shí)省力等優(yōu)勢(shì)[18]，既可以用于調(diào)查一定區(qū)域內(nèi)的生物類(lèi)群遺傳信息[19]，又可以對(duì)外來(lái)種或入侵種的擴(kuò)散趨勢(shì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，目前已經(jīng)有研究嘗試將eDNA 技術(shù)納入水生態(tài)安全監(jiān)測(cè)體系[20]。這些研究進(jìn)一步表明了用eDNA技術(shù)調(diào)查和研究中華鱘的可行性。

目前，利用eDNA 對(duì)長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)進(jìn)行研究已有不少探索[21]，其中已有學(xué)者利用eDNA 方法研究中華鱘的分布特征。如探討宜昌—南京江段中華鱘eDNA 的季節(jié)性分布特征[22]、長(zhǎng)江口特定區(qū)域內(nèi)中華鱘的種群特征[23]，以及宜昌江段中華鱘的月度變化特征[24]等。由于中華鱘洄游時(shí)大部分在中下層水域游動(dòng)，不同水層中華鱘eDNA 的豐度可能因此有差異，目前有關(guān)在長(zhǎng)江水體中分層采集中華鱘eDNA 的研究鮮有報(bào)道，在長(zhǎng)江流域不同區(qū)域同時(shí)開(kāi)展中華鱘eDNA 采樣及豐度對(duì)比分析的研究也少見(jiàn)。筆者篩選評(píng)估了文獻(xiàn)報(bào)道的中華鱘eDNA 引物，并用篩選后的特異性引物擴(kuò)增了從中華鱘產(chǎn)卵場(chǎng)（宜昌江段）至長(zhǎng)江入?？诘? 個(gè)點(diǎn)位的中華鱘eDNA，分析了不同點(diǎn)位以及不同水層中檢測(cè)到的中華鱘eDNA 的差異，以期為后續(xù)基于eDNA 開(kāi)展中華鱘種群研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣品DNA 提取

中華鱘、長(zhǎng)江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）、達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）的肌肉組織采集自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，青魚(yú)（Mylopharyngodon piceus）、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichthys nobilis）購(gòu)自市場(chǎng)。取保存完好的上述7 種動(dòng)物的肌肉組織30 mg，采用TIANGEN 公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型），依據(jù)使用說(shuō)明書(shū)分別提取動(dòng)物基因組DNA，主要步驟如下：56 ℃水浴條件下加入緩沖液溶解組織樣品，溶解完全后加入后續(xù)緩沖液和無(wú)水乙醇處理，轉(zhuǎn)移至吸附柱上加多種緩沖液離心，最后滴加洗脫緩沖液TE 洗脫DNA，將所得DNA 樣品保存于?80 ℃?zhèn)溆茫鳛橄乱徊教禺愋砸锖Y選的模板。

1.2 特異性引物篩選

以“中華鱘”“達(dá)氏鱘”“引物”“環(huán)境DNA”“eDNA”“基因”“擴(kuò)增”等為關(guān)鍵詞，檢索中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）和Web of Science 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到4 組中華鱘特異引物（表1），對(duì)這些引物進(jìn)行擴(kuò)增特異性驗(yàn)證及篩選，以供建立中華鱘eDNA 擴(kuò)增方法參考。

表1 文獻(xiàn)發(fā)表的中華鱘基因擴(kuò)增引物Table 1 Literature published on Acipenser sinensis gene amplification primers

合成表1 中引物，以江豚、中華鱘、達(dá)氏鱘和青魚(yú)、草魚(yú)、鰱、鳙組織提取到的DNA 樣品為模板，用不同的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳比較分析PCR 產(chǎn)物特異性。使用2×Fast HiFi PCR MasterMix（GeneZe）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，25 μL 擴(kuò)增體系包括稀釋成50 ng/μL 的模板1 μL，每個(gè)引物各0.5 μL（10μmol/L），12.5 μL 的2×Fast HiFi PCR MasterMix。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min。熱循環(huán)包括：94 ℃變性30 s；參照不同引物報(bào)道的擴(kuò)增條件，選擇對(duì)應(yīng)的退火溫度，引物1～4 分別為50、56、55、50 ℃，擴(kuò)增30 s；72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物用1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，根據(jù)所測(cè)PCR 產(chǎn)物的電泳圖譜和回收到的樣品濃度對(duì)這4 組引物進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.3 環(huán)境DNA 樣品采集

2022 年9 月，選擇長(zhǎng)江流域中有中華鱘和長(zhǎng)江江豚調(diào)查報(bào)道的4 個(gè)相關(guān)區(qū)域進(jìn)行eDNA 樣品的斷面采樣。采樣斷面包括長(zhǎng)江中游葛洲壩下中華鱘產(chǎn)卵場(chǎng)附近的宜昌江段區(qū)域〔斷面南側(cè)采樣點(diǎn)（111.293 7°E，30.681 1°N）、斷面北側(cè)采樣點(diǎn)（111.295 5°E，30.683 3°N）〕，長(zhǎng)江中游岳陽(yáng)市洞庭湖湖口附近區(qū)域〔斷面西側(cè)采樣點(diǎn)（113.102 1°E，29.404 2°N）、斷面東側(cè)采樣點(diǎn)（113.105 4°E，29.399 7°N）〕，長(zhǎng)江中下游分界九江市鄱陽(yáng)湖湖口附近區(qū)域〔斷面西側(cè)采樣點(diǎn)（116.217 8°E，29.745 8°N）、斷面東側(cè)采樣點(diǎn)（116.221 6°E，29.744 7°N）〕，以及上海崇明島和長(zhǎng)興島之間靠近長(zhǎng)江入?？诟浇鼌^(qū)域〔斷面南側(cè)采樣點(diǎn)（121.737 5°E，31.422 8°N）、斷面北側(cè)采樣點(diǎn)（121.761 7°E，31.455 5°N）〕。4 個(gè)采樣點(diǎn)的具體分布見(jiàn)圖1。

圖1 4 個(gè)采樣區(qū)域特征和采樣點(diǎn)位分布Fig.1 Characteristics of four sampling areas and distribution of sampling points

在每個(gè)采樣斷面分左右岸分別使用采水器采集水下0.5 m 作為表層水樣和水下15 m 作為底層水樣，在每個(gè)采樣點(diǎn)采集1 份5 L 水樣，采集器在使用前進(jìn)行漂洗和消毒，采集人員佩戴一次性手套，取樣后更換。共計(jì)采集16 個(gè)點(diǎn)位的eDNA 樣品，具體點(diǎn)位編號(hào)和命名：Y1（宜昌北側(cè)表層），Y2（宜昌北側(cè)底層），Y3（宜昌南側(cè)表層），Y4（宜昌南側(cè)底層）；D1（洞庭湖湖口東側(cè)表層），D2（洞庭湖湖口東側(cè)底層），D3（洞庭湖湖口西側(cè)表層），D4（洞庭湖湖口西側(cè)底層）；P1（鄱陽(yáng)湖湖口東側(cè)表層），P2（鄱陽(yáng)湖湖口東側(cè)底層），P3（鄱陽(yáng)湖湖口西側(cè)表層），P4（鄱陽(yáng)湖湖口西側(cè)底層）；S1（長(zhǎng)江入?？诒眰?cè)表層），S2（長(zhǎng)江入?？诒眰?cè)底層），S3（長(zhǎng)江入海口南側(cè)表層），S4（長(zhǎng)江入?？谀蟼?cè)底層）。水樣使用真空泵現(xiàn)場(chǎng)抽濾，將5 L 水樣 的eDNA 抽濾至1 張0.45 μm 孔徑的PES 濾膜（Pall Corporation）上，過(guò)濾同樣體積的純凈水作為陰性對(duì)照。將濾膜裝于5 mL 凍存管中，冷凍運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于?80 ℃超低溫冰箱，之后盡快進(jìn)行DNA 提取。

1.4 環(huán)境DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

使用QIAGEN 公司的DNeasy? PowerWater?Kit 試劑盒提取濾膜DNA 樣本，具體過(guò)程：將5 L 水樣過(guò)濾得到的濾膜剪裁，加入裂解液后在渦旋振蕩器上振蕩，離心取上清液加入后續(xù)溶液處理，轉(zhuǎn)移至離心柱上，離心柱用多種緩沖液洗滌后加入100 μL的洗脫液洗脫得到eDNA 樣品，將提取的eDNA 樣品置于?80 ℃冷凍保存。不同采樣點(diǎn)的樣品分開(kāi)保存，避免交叉污染。

以4 個(gè)點(diǎn)位提取的eDNA 樣品為模板，選取經(jīng)組織樣品篩選得到的特異性較高的引物，用相同條件擴(kuò)增，同樣取50 ng 的eDNA 樣品作為模板，使用步驟2 中特異性引物的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物使用TaKaRA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）膠回收試劑盒回收目的片段。

1.5 測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

已有研究表明，根據(jù)中華鱘基因設(shè)計(jì)的引物可以很好地區(qū)分中華鱘和長(zhǎng)江中的常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)，但是會(huì)檢測(cè)到一些親緣較近的鱘魚(yú)，可以通過(guò)測(cè)序?qū)⒉煌N類(lèi)的鱘魚(yú)區(qū)分出來(lái)[22]。本研究采用高通量測(cè)序的方法檢測(cè)中華鱘的eDNA，有效避免長(zhǎng)江中其他鱘類(lèi)eDNA 的干擾。

將成功擴(kuò)增的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司，連接測(cè)序接頭建庫(kù)后，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)大小，使用Qubit3.0 熒光定量?jī)x將所有樣本按照1∶1 的等體積混合進(jìn)行文庫(kù)濃度測(cè)定。使用Illumina Miseq?平臺(tái)（美國(guó)）進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（sequenced reads）。去除引物接頭序列測(cè)序后，將得到的PE reads 根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，將成對(duì)reads 拼接成1 條序列，根據(jù)各樣本barcode 序列和引物序列拼接后數(shù)據(jù)中分割出各樣本數(shù)據(jù)，并校正序列方向，區(qū)分樣本后，對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾，最后得到各樣本測(cè)序結(jié)果。

操作分類(lèi)單元（OTUs）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。從各樣本測(cè)序結(jié)果中提取非重復(fù)序列，所有樣本去冗余序列合并后去除沒(méi)有重復(fù)的單序列；按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTUs 聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，最終得到OTUs 的代表序列。將所有優(yōu)化序列比對(duì)至OTUs代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，從而完成OTUs 聚類(lèi)。利用BLAST（basic local alignment search tool）將序列與NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對(duì)，篩選出序列的最佳比對(duì)結(jié)果，并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，以相似度大于97%的序列注釋OTUs 以用于后續(xù)分類(lèi)，進(jìn)一步驗(yàn)證引物的特異性，分析中華鱘eDNA 分布特征。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性評(píng)估

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表1 中的2 號(hào)引物的特異性最強(qiáng)，該引物的巢氏PCR 第1 輪擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)觀(guān)察不同組織在100～600 bp 范圍內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn)，使用其外引物即可得到特異性的鱘類(lèi)PCR 產(chǎn)物（第1～4 泳道），擴(kuò)增條帶大小與2 號(hào)引物第1 輪擴(kuò)增產(chǎn)物310 bp[22]大小相吻合。由圖2可知，中華鱘肌肉和肝臟組織擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物條帶（第1 泳道和第2 泳道）最清晰；達(dá)氏鱘的肌肉和肝臟組織也能被擴(kuò)增出較為明顯的產(chǎn)物條帶（第3 泳道和第4 泳道），但不如中華鱘的特異性強(qiáng)；而2 號(hào)引物對(duì)于江豚和青魚(yú)、草魚(yú)、鰱、鳙組織的基因擴(kuò)增條帶很模糊，說(shuō)明2 號(hào)引物適合于鱘類(lèi)基因的擴(kuò)增，特別對(duì)中華鱘基因的擴(kuò)增效果良好。

圖2 長(zhǎng)江中華鱘引物特異性評(píng)估2 號(hào)引物凝膠電泳圖譜Fig.2 Primer specificity evaluation gel electrophoresis pattern of primer No.2 of Chinese Sturgeon

2.2 環(huán)境DNA 提取、擴(kuò)增和測(cè)序

將所得濾膜樣品進(jìn)行DNA 提取后，成功提取總計(jì)16 個(gè)點(diǎn)位的eDNA 樣品。以提取的環(huán)境樣品為模板，使用篩選得到的2 號(hào)引物，成功擴(kuò)增回收純化得到中華鱘的目的基因片段。樣品測(cè)序的稀釋曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。16 條曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)16 個(gè)采樣點(diǎn)位編號(hào)，隨測(cè)序得到的reads 數(shù)增加，各樣品OTUs 種類(lèi)數(shù)均到達(dá)平臺(tái)期，判斷本次測(cè)序深度適宜。

圖3 不同點(diǎn)位eDNA 測(cè)序樣品的Alpha 指數(shù)稀釋性曲線(xiàn)Fig.3 Alpha exponential dilution curves of sequenced samples at different sampling points

2.3 eDNA 檢測(cè)到的中華鱘分布情況

將測(cè)序得到的序列進(jìn)行聚類(lèi)得到OTUs 后，通過(guò)比對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行注釋?zhuān)晒ψ⑨尦? 種長(zhǎng)江現(xiàn)有鱘類(lèi)，分別是中華鱘、達(dá)氏鱘、雜交鱘（Acipenser_dabryanus×Acipenser_schrenckii）和史氏鱘（Acipenser schrenckii）。各點(diǎn)位獲得的鱘類(lèi)OTUs中所含的reads 數(shù)量見(jiàn)圖4 和表2。

圖4 各采樣點(diǎn)位檢測(cè)獲得的鱘類(lèi)OTUs 所含reads 數(shù)Fig.4 Number of reads contained in sturgeon OTUs detected at each site

表2 各點(diǎn)位檢測(cè)到的鱘類(lèi)OTUs 所含reads 數(shù)Table 2 Number of reads contained in sturgeon OTUs detected at each site 個(gè)

由表2 可以看出，在16 個(gè)點(diǎn)位中，達(dá)氏鱘僅在個(gè)別點(diǎn)位有少量檢出，史氏鱘在各點(diǎn)位都有少量檢出，各點(diǎn)位的雜交鱘reads 檢出量最多。中華鱘reads 在各點(diǎn)位均有檢出，其中宜昌江段斷面最多，洞庭湖湖口斷面最少，16 個(gè)點(diǎn)位中，Y1 點(diǎn)位水樣中中華鱘reads 檢出量最高，D2 點(diǎn)位水樣的中華鱘reads 檢出量最低。就4 個(gè)區(qū)域來(lái)說(shuō)，宜昌江段斷面的中華鱘reads 數(shù)量最多，每個(gè)樣品平均檢出46 767個(gè)；其次是鄱陽(yáng)湖湖口斷面，平均檢出35 607 個(gè)；最少的是洞庭湖湖口斷面，平均檢出13 500 個(gè)。各區(qū)域相比，長(zhǎng)江入?？跀嗝嫦啾榷赐ズ跀嗝嫫骄?11.07%；鄱陽(yáng)湖湖口斷面與長(zhǎng)江入?？跀嗝嫦啾绕骄?4.96%；宜昌江段斷面與鄱陽(yáng)湖湖口斷面相比平均多31.34%。最多的宜昌江段斷面數(shù)量是最少的洞庭湖湖口斷面數(shù)量的3.46 倍。

同時(shí)，對(duì)比表層和底層樣品中測(cè)得的中華鱘eDNA 數(shù)據(jù)（圖5）可知，洞庭湖湖口斷面檢出的中華鱘eDNA 表層比底層總計(jì)多5 倍以上，表層和底層的差異最為明顯；宜昌江段斷面兩側(cè)點(diǎn)位檢出的中華鱘eDNA 表層與底層相差2.87%，2 種水深檢出的eDNA 差異較?。慧蛾?yáng)湖湖口斷面表層比底層總體上少21.99%，是所有區(qū)域中唯一表層比底層檢出中華鱘eDNA 少的區(qū)域；長(zhǎng)江入?？跀嗝姹韺颖鹊讓涌傆?jì)多了38.7%，表層中華鱘eDNA 的檢出量較高。從4 個(gè)斷面整體上看，表層水樣中檢出的中華鱘eDNA 比底層水樣多了19.13%，其中，部分?jǐn)嗝姹韺雍偷讓铀畼娱g差異十分明顯，而有的斷面不同水層檢出的eDNA 差異則較小?？梢钥闯鲈诖蠖鄶?shù)斷面，不同水深條件下中華鱘eDNA 的檢出量存在一定差別。

圖5 不同點(diǎn)位表層和底層水樣檢出中華鱘eDNA 情況Fig.5 eDNA of Chinese Sturgeon detected in the surface and bottom water samples at different sampling points

3 討論

3.1 eDNA 檢測(cè)中華鱘分布的可行性及其優(yōu)勢(shì)

中華鱘的穩(wěn)定有效監(jiān)測(cè)是保護(hù)中華鱘的重要手段之一，在目前長(zhǎng)江大保護(hù)[27]和10 年禁漁的背景下[28]，要利用中華鱘組織樣本對(duì)中華鱘的遺傳多樣性、分布情況或者種群特征進(jìn)行研究，只能依靠偶然獲得的少量個(gè)體樣本[13]，該方法可以得到的序列遺傳信息較少，且樣品來(lái)源不穩(wěn)定。而使用eDNA 對(duì)中華鱘[29]進(jìn)行無(wú)損且高效的檢測(cè)是行之有效的方法。

利用eDNA 可以調(diào)查生物多樣性[30]或者珍稀動(dòng)物[31]，eDNA 已經(jīng)用于大范圍檢測(cè)魚(yú)類(lèi)種群分布[32]，甚至用于研究大型水生動(dòng)物鯨鯊的遺傳多樣性[33]。我國(guó)也有利用eDNA 調(diào)查長(zhǎng)江上游珍稀魚(yú)類(lèi)[34]和長(zhǎng)江中下游旗艦物種江豚的分布特征[35]等成功案例，前人研究為使用eDNA 監(jiān)測(cè)中華鱘奠定了一定的基礎(chǔ)[22,24]。本研究選取了從葛洲壩到入?？诘拈L(zhǎng)距離江段中的歷史產(chǎn)卵場(chǎng)、兩大通江湖泊湖口和長(zhǎng)江入海口4 個(gè)典型區(qū)域的斷面，分表、底兩層進(jìn)行取樣，在時(shí)間上選取了臨近中華鱘繁殖期之前，中華鱘向葛洲壩下產(chǎn)卵場(chǎng)移動(dòng)這一中華鱘活動(dòng)較為活躍的9 月進(jìn)行采樣，可以在一定程度上揭示繁殖期前的中華鱘種群分布情況。

3.2 eDNA 檢測(cè)到的中華鱘分布情況

研究中，通過(guò)組織樣品篩選得到了有較高特異性的中華鱘基因擴(kuò)增引物，并成功從4 個(gè)采樣點(diǎn)的表層和底層的環(huán)境樣品中，擴(kuò)增得到中華鱘的目的基因序列，表明篩選出的特異性引物能有效檢測(cè)中華鱘的eDNA。除成功擴(kuò)增出中華鱘目的基因序列外，測(cè)序還得到了之前報(bào)道存在于長(zhǎng)江中的雜交鱘的大量eDNA 和少量的史氏鱘以及極少的達(dá)氏鱘eDNA，檢測(cè)結(jié)果與長(zhǎng)江歷史調(diào)查中的鱘類(lèi)物種一致[36]。測(cè)序結(jié)果顯示雜交鱘在各點(diǎn)位eDNA 的檢出量均明顯高于中華鱘，表明作為外來(lái)物種的雜交鱘可能在長(zhǎng)江中廣泛存在。前人對(duì)長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)的研究中也有不少中華鱘的觀(guān)測(cè)記錄，其中2017 年7—10 月底在長(zhǎng)江口區(qū)域，皆檢測(cè)到了中華鱘幼體[37]；在對(duì)宜昌葛洲壩下游中華鱘產(chǎn)卵場(chǎng)的調(diào)查中，也曾長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)到中華鱘在該水域的活動(dòng)[38]；對(duì)洞庭湖和鄱陽(yáng)湖的魚(yú)類(lèi)調(diào)查研究中，也觀(guān)測(cè)到中華鱘的出現(xiàn)[39-40]。這些報(bào)道均與本研究揭示的4 個(gè)區(qū)域檢測(cè)到的中華鱘eDNA 相一致，表明了eDNA 技術(shù)在檢測(cè)中華鱘分布特征方面的可行性。

本次調(diào)查時(shí)間為9 月，檢出的中華鱘序列在宜昌江段豐度最高，推測(cè)是因?yàn)橹腥A鱘即將進(jìn)入繁殖期（11 月）[6]，開(kāi)始頻繁出現(xiàn)在宜昌；鄱陽(yáng)湖口中華鱘序列數(shù)高于入?？?，可能是因?yàn)橹腥A鱘游入長(zhǎng)江產(chǎn)卵時(shí)間為6—8 月，調(diào)查時(shí)中華鱘已經(jīng)大部分游過(guò)長(zhǎng)江口。從調(diào)查點(diǎn)位表層和底層樣品的檢出結(jié)果對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，中華鱘eDNA 在表層水樣和底層水樣的檢出有明顯差別，這可能是因?yàn)橹腥A鱘在洄游過(guò)程中，多分布于江水的中下層，偶爾移至上層[7]，因此不同水深檢出中華鱘eDNA 的差異性也值得關(guān)注。而在對(duì)于eDNA 采樣的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，在空間上更全面地采樣可以揭示物種更加精細(xì)的分布模式[41]。建議在今后的長(zhǎng)江中華鱘eDNA 調(diào)查中可采用混合或者立體采樣，這樣比單一空間位點(diǎn)的采樣能夠更加全面地采集到中華鱘的信息。

本文通過(guò)水生動(dòng)物組織篩選得到特異性引物，從測(cè)序結(jié)果上看，其可能是適用于長(zhǎng)江現(xiàn)有鱘類(lèi)的通用引物，僅從產(chǎn)物電泳結(jié)果上看不易嚴(yán)格區(qū)分鱘類(lèi)，但可以通過(guò)測(cè)序?qū)㈤L(zhǎng)江中的鱘類(lèi)區(qū)分開(kāi)。后續(xù)研究可以通過(guò)繼續(xù)開(kāi)發(fā)新的特異引物，或者依靠長(zhǎng)江鱘類(lèi)分布的區(qū)域性特征和區(qū)域的歷史調(diào)查結(jié)果，更加精確地區(qū)分引物，并通過(guò)高通量測(cè)序?qū)﹂L(zhǎng)江鱘類(lèi)進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別。

4 結(jié)論

（1）從4 對(duì)中華鱘相關(guān)引物中篩選得到了有較高特異性的中華鱘基因擴(kuò)增引物，從環(huán)境樣品中檢測(cè)出中華鱘eDNA 并成功測(cè)序驗(yàn)證。

（2）使用篩選得到的特異性引物共測(cè)得了包含中華鱘在內(nèi)的4 種長(zhǎng)江鱘類(lèi)基因，通過(guò)測(cè)序很好地區(qū)分了4 種鱘類(lèi)，其中雜交鱘的eDNA 檢出量最高，中華鱘其次，達(dá)氏鱘的eDNA 檢出量最低。作為長(zhǎng)江外來(lái)物種的雜交鱘可能在長(zhǎng)江中廣泛存在，中華鱘eDNA 的檢測(cè)結(jié)果也與之前報(bào)道的中華鱘的形態(tài)學(xué)觀(guān)察較為吻合。

（3）中華鱘eDNA 在宜昌江段檢出量最高，可能是因?yàn)橹腥A鱘即將進(jìn)入繁殖期，開(kāi)始出現(xiàn)在宜昌河段準(zhǔn)備繁殖。中華鱘eDNA 在表層水樣和底層水樣的檢出量有一定差別，后續(xù)中華鱘eDNA 調(diào)查采用混合或者立體采樣可能會(huì)比單一空間位點(diǎn)的采樣能夠得到更加豐富的eDNA 信息。還可以通過(guò)開(kāi)發(fā)新的特異引物，或者與其他調(diào)查方法相結(jié)合的方式開(kāi)展更全面的調(diào)查研究，以保護(hù)中華鱘。