抗生素溶桿菌13-6次生代謝物Myxin對水稻條斑病菌活體轉(zhuǎn)錄組的影響

摘要：近年來，水稻細(xì)菌性條斑病已成為影響我國水稻產(chǎn)量的重要病害之一。探究抗生素溶桿菌13-6次生代謝物對水稻條斑病菌的影響，明確抗生素溶桿菌13-6次生代謝物對水稻細(xì)菌性條斑病的防病機(jī)制，對于實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。在水稻感病品種日本晴（4葉期）上接種條斑病菌YM15，48 h后用抗生素溶桿菌13-6次生代謝物（480 μg/mL）處理，然后進(jìn)行活體轉(zhuǎn)錄組測序分析、生物信息分析并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，經(jīng)抗生素溶桿菌13-6次生代謝物處理后，將處理組和對照組與參考基因組基因進(jìn)行對比，共得到203個(gè)差異顯著基因，上調(diào)基因125個(gè)，下調(diào)基因78個(gè)。隨機(jī)挑選10個(gè)基因（上調(diào)6個(gè)，下調(diào)4個(gè)）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。在GO功能富集中，差異基因主要集中在相應(yīng)刺激和生物調(diào)控等過程；在KEGG功能富集中，差異基因主要集中在雙組分系統(tǒng)等代謝通路。本研究發(fā)現(xiàn)，抗生素溶桿菌13-6次生代謝物可顯著影響病原菌中與致病性相關(guān)的基因，如鞭毛合成相關(guān)基因和趨化性相關(guān)基因。此外，抗生素溶桿菌13-6次生代謝物還可影響KEGG代謝通路中與鞭毛組裝相關(guān)的基因、雙組分系統(tǒng)以及氨基酸代謝過程相關(guān)基因表達(dá)，為進(jìn)一步闡明Myxin對水稻細(xì)菌性條斑病的作用靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；細(xì)菌性條斑??；抗生素溶桿菌；次生代謝物；基因表達(dá)差異；活體轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S435.111.4+9" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0117-10

收稿日期：2023-11-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（編號：32060601）；云南省“萬人計(jì)劃”中國工業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（編號：YNWR-CYJS-2019-046）。

作者簡介：孟 涵（1997—），女，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：1964391536@qq.com。

通信作者：姬廣海，博士，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：550356818@qq.com。

水稻是世界上最重要的糧食作物，全球有一半以上的人口以水稻為主食。但水稻的生產(chǎn)受到多種病害的影響，報(bào)道顯示，真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲均可侵染水稻，導(dǎo)致稻瘟病、水稻根結(jié)線蟲病、南方水稻黑條矮縮病、水稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑病的發(fā)生^［1-5］。

由稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，簡稱Xoc）侵染引起的水稻細(xì)菌性條斑?。╞acterial leaf streak，簡稱BLS）是我國乃至世界水稻生產(chǎn)上的第二大細(xì)菌性病害。該病害于1918年在菲律賓首次發(fā)現(xiàn)^［6］，而后在亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)、澳大利亞北部和非洲西部被相繼報(bào)道^［7］；1957年，國內(nèi)首次報(bào)告水稻條斑病，此后，水稻條斑病被列為一種檢疫性病害^［8］。近年來，該病害在云南的大部分稻區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重危害水稻產(chǎn)量，造成水稻減產(chǎn)15%～25%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%～60%^［9］。

溶桿菌屬于γ變形菌亞門黃單胞菌科^［10-11］，在自然界中廣泛分布并存在，具有高滑動(dòng)性和高 G+C 含量的特征，對多種病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有溶菌活性^［12-13］。目前，已發(fā)現(xiàn)的溶桿菌種類有抗生素溶桿菌（Lysobacter antibioticus）、產(chǎn)酶溶桿菌（L. enzymogenes）和辣椒溶桿菌（L. capsici）等?？股厝軛U菌13-6可產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的吩嗪類化合物，如Myxin^［14］、對氨基苯甲酸等，已有研究表明此類活性物質(zhì)對水稻細(xì)菌性條斑病菌具有較高的抑菌活性^［11］。本研究對抗生素溶桿菌13-6次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行濃縮抽提和分離純化得到Myxin，用其處理接種病原菌YM15的水稻葉片，后續(xù)通過活體轉(zhuǎn)錄組測序來探尋Myxin對水稻細(xì)菌性條斑病菌基因表達(dá)的影響，并通過qRT-PCR加以驗(yàn)證。以尋找Myxin作用于Xoc YM15的作用靶點(diǎn)，挑選經(jīng)Myxin處理前后差異表達(dá)明顯的基因進(jìn)行基因突變并驗(yàn)證其功能。

1 材料與方法

1.1 水稻選材

選用感病品種日本晴作為水稻試驗(yàn)材料，試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地溫室開展。水稻種植于溫室水稻池中，5行×6株，整個(gè)生育期管理按常規(guī)栽培管理進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

本試驗(yàn)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室完成。試驗(yàn)時(shí)間為2022年6—7月。

1.3 菌株和培養(yǎng)條件

水稻細(xì)菌性條斑病菌YM15（NCBI基因組序列登錄號：CP007810）、抗生素溶桿菌13-6（簡稱 13-6），均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，簡稱NA）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，細(xì)菌學(xué)蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，酵母浸膏 1 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH值調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌后備用^［15］。

NB培養(yǎng)基：不添加瓊脂的NA培養(yǎng)基。

KB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO4 1.5 g，甘油10 mL，瓊脂20 g（液體不添加瓊脂），加蒸餾水定容至1 L，pH值調(diào)整至7.0，121 ℃ 高壓滅菌后備用。

1.4 抗生素溶桿菌13-6次生代謝物Myxin分離純化

抗生素溶桿菌13-6（簡稱13-6）在KB固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)24 h，活化后的13-6于KB液體培養(yǎng)基中過夜搖培，再以1%的接種量轉(zhuǎn)接至500 mL KB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min搖培72 h得到 13-6 發(fā)酵液。發(fā)酵液與乙酸乙酯 1 ∶1 混合萃取3次，取上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉除水后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到粗提物。

粗提物按照甲醇 ∶三氯甲烷=7 ∶3的體積比分別在硅膠板上利用薄層色譜法（TLC），根據(jù)比移值（Rf）選取合適的洗脫體系。用通用顯色劑（濃硫酸 ∶乙醇=1 ∶1）和5%重鉻酸鉀顯色劑（需要 150 ℃ 烤制后顯色）進(jìn)行顯色。

根據(jù)TLC檢測結(jié)果，最終確定洗脫體系及不同梯度設(shè)置。利用硅膠柱和凝膠柱根據(jù)洗脫體系對粗提物進(jìn)行分離，結(jié)合TLC檢測合并相同Rf值的組分。以Xoc YM15為指示菌，利用活性追蹤確定最終活性組分。

HPLC純化：將經(jīng)過硅膠柱和凝膠柱純化得到的組分采用RP-C18柱進(jìn)行分離純化。制備條件：40%乙腈，60%超純水，流速4 mL/min，半制備柱（RP-C18，9.4 mm×250 mm×5 μm），吸收波長 274 nm。檢測條件：10 μL樣品進(jìn)樣，流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈，流速 1 mL/min，檢測波長274 nm。HPLC檢測洗脫體系：0 min 20%B，5 min 35%B，19 min 50%B，20 min 60%B，23 min 100%B，27 min 100%B，28 min 20%B，30 min 20%B。

1.5 水稻接種

將Xoc YM15在NA培養(yǎng)基上活化后連續(xù)培養(yǎng)2代以恢復(fù)菌株毒性，再于NA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)36 h；活化后的Xoc YM15接種于NB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再以1%的接種量接種在500 mL NB培養(yǎng)基中搖培至D600 nm≈0.3備用。

在日本晴4葉期采用針刺法接種病原菌YM15，并在接種后48 h用13-6次生代謝物Myxin（480 μg/mL）進(jìn)行葉面噴霧處理。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

1.6.1 RNA提取

采取接種后的水稻葉片按照TRNzol Universal總RNA提取試劑參照說明書，進(jìn)行葉片總RNA提取。利用紫外分光光度計(jì)對提取的RNA純度和濃度進(jìn)行檢測，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性。

1.6.2 cDNA文庫構(gòu)建

用于RNA-seq的RNA樣品，每個(gè)樣品取1 μg RNA用于cDNA文庫構(gòu)建，總RNA送至北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，cDNA文庫由Genedenovo公司（中國廣州）在Illumina測序平臺上進(jìn)行測序。

1.6.3 cDNA合成

提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR。通過cDNA第1鏈合成試劑盒：FastKing RT Kit（With gDNase）合成cDNA，具體方法參照FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.4 RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析

測序的原始數(shù)據(jù)（raw data）通過fastQC軟件（v0.11.2版本）進(jìn)行評估，采用paired-end測序方式，兩端接頭插入片段長度，其中使用Trimmomatic（0.36.5）軟件低質(zhì)量的和帶接頭的raw data過濾得到高質(zhì)量的clean read。為保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，后續(xù)分析都基于clean reads。為明確抗生素溶桿菌13-6次生代謝物Myxin處理后處理組與對照組間的差異表達(dá)基因（DEGs），利用EdgeR進(jìn)行DEGs分析。為明確差異表達(dá)基因的功能，分別通過Goatools （http：//github.com/tanghaibao/Goatools）和KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）對GO功能和KEGG功能進(jìn)行分析。將DEGs注釋到GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中，獲得差異表達(dá)基因的GO功能注釋和代謝途徑通路信息。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證差異基因

為了評估RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性，用測序返還的樣品RNA，隨機(jī)挑選顯著差異基因富集中的10個(gè)差異表達(dá)基因（6個(gè)上調(diào)基因和4個(gè)下調(diào)基因）進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR引物設(shè)計(jì)見表4，內(nèi)參基因?yàn)間yrB，所選擇的差異表達(dá)基因的相對表達(dá)水平采用2^-ΔΔCT的方法進(jìn)行計(jì)算^［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

4個(gè)水稻葉片樣本總共得到1 566 508 200 bp raw reads，過濾后得到1 129 974 206 bp clean reads，clean reads占raw reads的比值均在92.00%以上。Q20為97.01%～97.50%，Q30為 92.60%～93.73%，GC平均含量約為52.84%。表明整體測序質(zhì)量好，數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)生物信息學(xué)分析，并能滿足后續(xù)做基因表達(dá)定量及差異基因表達(dá)分析基本要求。

2.2 基因表達(dá)定量

為了確定13-6次生代謝物處理Xoc YM15后基因的表達(dá)差異，本研究將Xoc YM15接種4葉期水稻，在第48 h用13-6次生代謝物Myxin（480 μg/mL）處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，然后將處理組和對照組與參考基因組所有基因進(jìn)行對比，共得到3 582個(gè)基因，對其按差異顯著性標(biāo)準(zhǔn) |log2（fold change）|≥1（Plt;0.05）進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)差異情況，共有203個(gè)差異顯著基因，其中有125個(gè)基因顯著上調(diào)，78個(gè)基因下調(diào)。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能注釋

通過GO功能富集分析可以初步了解水稻接種Xoc YM15并經(jīng)Myxin處理前后，YM15差異表達(dá)基因（DEG）情況及其主要生物學(xué)功能。通過注釋，將DEG歸為三大類，分別為細(xì)胞組分（cellular component，簡稱CC）、分子功能（molecular function，簡稱MF）和生物過程（biological process，簡稱BP）。其中147個(gè)基因?qū)儆谏镞^程，68個(gè)基因?yàn)榧?xì)胞組分，50個(gè)基因被GO歸類到分子功能。

在BP中，有121個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，26個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，主要分布在代謝過程、細(xì)胞過程、單組分過程、響應(yīng)刺激、生物調(diào)控和生物過程調(diào)控等功能；而在CC中，有56個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，12個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，主要分布于細(xì)胞部分、細(xì)胞和膜等功能。此外，在MF中，有38個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，12個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，主要分布在催化活性和結(jié)合等功能（圖1）。

通過對差異基因GO富集顯著性分析，受13-6次生代謝物Myxin影響的GO terms共有30個(gè)，差異富集最顯著的5個(gè)GO功能terms都和響應(yīng)與調(diào)節(jié)相關(guān)，分別為響應(yīng)化學(xué)物質(zhì)、響應(yīng)刺激、調(diào)控細(xì)胞過程、調(diào)控生物過程和生物調(diào)控（圖2）。其中響應(yīng)化學(xué)物質(zhì)中8個(gè)基因全部上調(diào)，功能聚集在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；響應(yīng)刺激中10個(gè)基因上調(diào)，1個(gè)基因下調(diào)，功能聚集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和環(huán)境適應(yīng)；調(diào)控細(xì)胞過程中8個(gè)基因上調(diào)，2個(gè)基因下調(diào)；調(diào)控生物過程和生物調(diào)控中均有10個(gè)基因上調(diào)，2個(gè)基因下調(diào)，且基因相同。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG功能注釋

為進(jìn)一步明確Myxin對Xoc YM15代謝途徑的影響，將Xoc YM15 DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因通過KEGG的富集分析被富集到63條通路，其中差異基因數(shù)前20的通路如圖3所示。主要富集通路（Plt;0.05）為ko02020雙組分系統(tǒng)、ko02030細(xì)菌趨化性和ko02040鞭毛組裝，分別屬于環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程2個(gè)類別。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG通路分析

將Xoc YM15 DEG與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，KEGG富集的前20條代謝通路可分為5個(gè)類別，分別為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程和有機(jī)系統(tǒng)。其中，主要富集代謝通路為全局和概覽地圖、氨基酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（圖4）。另外，差異基因數(shù)大于10的通路為細(xì)菌趨化性、雙組分系統(tǒng)和鞭毛組裝通路（圖3），其中雙組分系統(tǒng)差異基因涉及鞭毛合成、趨化運(yùn)動(dòng)、生物膜合成、氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能，包含部分細(xì)菌趨化性和鞭毛組裝通路基因。

2.5.1 Myxin對雙組分系統(tǒng)的影響

雙組分系統(tǒng)（two-component system，簡稱TCS）包括組氨酸激酶（histidine kinase，簡稱HK）和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，簡稱RR）2個(gè)部分，可控制細(xì)菌包括趨化性、營養(yǎng)利用、細(xì)胞分化和毒力等在內(nèi)的多種生理通路。細(xì)菌感應(yīng)到周圍環(huán)境的刺激信號后，組氨酸激酶通過磷酸化機(jī)制激活應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)或細(xì)胞機(jī)制觸發(fā)適應(yīng)性反應(yīng)^［16-19］。在該途徑中，共富集到25個(gè)差異基因，24個(gè)上調(diào)基因，1個(gè)下調(diào)基因。雙組分系統(tǒng)包含多個(gè)代謝通路，現(xiàn)對以下通路進(jìn)行分析：

2.5.1.1 Myxin對細(xì)菌趨化性和鞭毛組裝的影響

細(xì)菌運(yùn)動(dòng)代謝途徑的通路包括細(xì)菌趨化性和鞭毛組裝。在該代謝途徑中共富集到21個(gè)差異基因，且全部上調(diào)（表1、表2）。鞭毛作為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官可以幫助細(xì)菌逃離有害物質(zhì)。在鞭毛組裝代謝途徑中，共富集到13個(gè)差異基因且全部上調(diào)。由此說明13-6次生代謝物Myxin處理Xoc YM15后，使Xoc YM15的鞭毛組裝和細(xì)菌趨避性增強(qiáng)，從而對Myxin產(chǎn)生趨避作用。

2.5.1.2 Myxin對氧化磷酸化的影響

氧化磷酸化是主要的ATP產(chǎn)生方式，可在呼吸鏈電子傳遞過程中偶聯(lián)ATP的生成。在該過程中共富集到3個(gè)差異基因，分別為cyoD（ACU12_RS15685）、ctaC（ACU12_RS18735）和cydB（ACU12_RS18210），其中cydB（ACU12_RS18210）和ctaC（ACU12_RS18735）為下調(diào)基因，而cyoD（ACU12_RS15685）則呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢。在復(fù)合物Ⅳ上O2在細(xì)胞色素C氧化酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)生成H2O，在這一過程中可形成跨膜的質(zhì)子電化學(xué)勢能差，而這一勢能差可以被三磷酸腺苷合酶用于制造生物體中的能量分子ATP。本研究猜測，由于該過程中基因下調(diào)使勢能差降低或Myxin影響復(fù)合物Ⅳ上細(xì)胞色素C氧化酶中血紅素的活性，從而使病原菌合成ATP的數(shù)量減少。由此推測，Myxin可影響病原菌ATP的合成。

2.5.2 Myxin對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在所有調(diào)控途徑中共富集到25個(gè)差異基因，其中有24個(gè)上調(diào)基因、1個(gè)下調(diào)基因。主要代謝通路為雙組分系統(tǒng)，涉及鞭毛組裝、細(xì)菌趨化性、生物膜合成、氧化磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長與死亡和電子轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能。說明Myxin可能通過影響雙組分系統(tǒng)來增強(qiáng)病原菌對外界刺激信號的感知，從而使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。

2.5.3 Myxin對氨基酸代謝的影響

氨基酸代謝除與蛋白質(zhì)合成相關(guān)外，還與激素和次生代謝、能量和碳水化合物代謝、碳氮收支以及應(yīng)激反應(yīng)等密切相關(guān)^［20］。在本研究中，氨基酸代謝途徑在所有調(diào)控途徑中共富集到26個(gè)差異基因，其中有22個(gè)上調(diào)基因和4個(gè)下調(diào)基因，所屬代謝途徑見表3。根據(jù)Myxin處理后對氨基酸代謝途徑的影響推測Myxin可能使病原菌處于脅迫狀態(tài)，從而使氨基酸呈上調(diào)或下調(diào)趨勢以減弱Myxin對其的影響。

2.6 致病性相關(guān)差異表達(dá)基因分析

在與分泌系統(tǒng)相關(guān)的基因中，共富集到20個(gè)差異顯著基因（圖5-A），其中有9個(gè)為上調(diào)基因，主要?dú)w屬于Ⅲ型分泌系統(tǒng)和Ⅳ型分泌系統(tǒng)；11個(gè)下調(diào)基因，主要?dú)w屬于Ⅵ型分泌系統(tǒng)和Ⅱ型分泌系統(tǒng)。Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌有關(guān)基因下調(diào)，說明經(jīng)該系統(tǒng)分泌的水解酶減少，病原菌降解植物屏障的能力減弱，侵染宿主植物能力下降，即Myxin可影響病原菌水解酶的外泌，導(dǎo)致其致病性降低。

在本研究中，與鞭毛合成相關(guān)基因fliR（ACU12_RS10635）呈下調(diào)趨勢，且該基因與Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)；而其他與鞭毛相關(guān)基因均上調(diào)（圖5-B），說明Myxin可使病原菌對其產(chǎn)生趨避作用。

與趨化性相關(guān)基因中，共富集到20個(gè)差異顯著基因，且全部上調(diào)（圖5-C）。包括雙組分系統(tǒng)趨化蛋白/趨化性響應(yīng)調(diào)節(jié)器cheA/cheY、趨化反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白谷氨酸甲基酯酶和甲基趨化性受體蛋白（MCP）等。由此推測，Myxin可使病原菌對其產(chǎn)生負(fù)趨化性。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

通過隨機(jī)挑選顯著差異基因富集中的10個(gè)差異表達(dá)基因，4個(gè)下調(diào)基因murC（UDP-N-acetylmuramate-L-alanine ligase），proC（pyrroline-5-carboxylate reductase），prpR（propionate catabolism operon regulatory protein），pfeA（TonB-dependent receptor），6個(gè)上調(diào)基因cheY（chemotaxis response regulator），cheA（chemotaxis protein），flhA（flagellar biosynthesis protein FlhA），fliA（RNA polymerase sigma factor），flgG（flagellar biosynthesis cell-distal portion of basal-body rod），dosP（c-di-GMP phosphodiesterase），設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表4），以活體條件下經(jīng)Myxin處理和未經(jīng)Myxin處理的條斑病菌YM15 RNA為樣品，gyrB為內(nèi)參，利用 qRT-PCR測定以上10個(gè)基因的表達(dá)量并與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，10個(gè)基因的 qRT-PCR 測定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致（圖6），表明測序結(jié)果可靠。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，與分泌系統(tǒng)相關(guān)基因共富集到10個(gè)上調(diào)基因，主要?dú)w屬于Ⅲ型分泌系統(tǒng)和Ⅳ型分泌系統(tǒng)；11個(gè)下調(diào)基因，主要?dú)w屬于Ⅵ型分泌系統(tǒng)和Ⅱ型分泌系統(tǒng)。

已有研究表明，T3SS是革蘭氏陰性病原菌中關(guān)鍵的致病因子^［21-22］，可通過篩選T3SS抑制劑或突變其關(guān)鍵致病基因來降低T3SS的致病性。目前，已篩選到多種對T3SS有作用的抑制劑，如CZ-1、CZ-4和CZ-9等^［23-24］。植物病原細(xì)菌的致病力和引發(fā)HR的能力由hrp基因決定^［25-26］。hrp基因簇包括hrc（hypersensitive response and conseverd）基因、hpa（hrp associated protein）基因或hop（hrp outer protein）基因以及一部分非保守的hrp基因。將hrp基因簇（如hrpE、hrpG及hrc）突變后，可使致病性大部分或完全喪失。而在本研究中，接種YM15后的水稻經(jīng)抗生素溶桿菌13-6次生代謝物Myxin處理后，與Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因明顯上調(diào)，由此推測Myxin可能使病原菌處于脅迫狀態(tài)，從而使基因上調(diào)表達(dá)。而Myxin對病原菌YM15的作用時(shí)間規(guī)律有待進(jìn)一步探究。

與鞭毛相關(guān)基因共富集到29個(gè)上調(diào)基因，包括基因fliC、fliQ、flgG和flhB等。已有研究表明，在植物病原菌黃單胞菌中，同源調(diào)控因子RopN1和RopN2在毒力性狀、鞭毛生物合成等方面發(fā)揮不同的調(diào)控作用。在野油菜黃單胞菌中，RopN2可以直接通過fliC和fliQ來調(diào)控鞭毛的合成，進(jìn)而影響病原菌的運(yùn)動(dòng)性^［27］。此外，將RopN2基因突變后，會(huì)使基因flgG、fliC和flhB的表達(dá)顯著下調(diào)^［28］。由此推測接種病原菌后再用Myxin處理，可使病原菌對Myxin產(chǎn)生趨避作用。

在本研究中，與細(xì)菌趨化性相關(guān)的上調(diào)基因主要為cheA、cheY、tsr和MCP等。MCP即甲基趨化性受體蛋白（methyl-accepting chemotaxis protein），作為一種跨膜細(xì)菌傳感器蛋白，可控制細(xì)菌趨化性^［29］。MCP能夠使細(xì)菌感受到外界環(huán)境的刺激，從而使細(xì)菌定向運(yùn)動(dòng)，趨向有利于細(xì)菌生長的物質(zhì)，避開對細(xì)菌生長有害的物質(zhì)，從而達(dá)到趨利避害的目的^［30］。此病原菌受外界刺激時(shí)，MCP相關(guān)基因的缺失導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)性幾乎全部喪失^［29］。由此說明，MCP在細(xì)菌趨化性方面有著至關(guān)重要的作用。

氨基酸是蛋白質(zhì)、能量和氮代謝的核心成分，它們還是在植物-微生物相互作用中具有特定功能的各種活性化合物的前體。氨基酸代謝對植物內(nèi)建立系統(tǒng)免疫反應(yīng)的免疫信號傳遞有至關(guān)重要的作用，可提供信號分子、防御化合物和營養(yǎng)物質(zhì)，以形成與微生物的相互作用^［31］。已有研究表明，傷寒沙門氏菌的芳香族氨基酸的合成可促進(jìn)其增殖^［32］。此外，有研究顯示Xoo可能在低氧條件下通過促進(jìn)芳香族氨基酸的合成促進(jìn)其致病基因的表達(dá)和增殖進(jìn)而促進(jìn)感染^［33］。而在本研究中，芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）生物合成途徑顯著上調(diào)，說明抗生素溶桿菌13-6次生代謝物Myxin可能使病原菌YM15處于脅迫狀態(tài)從而使與芳香族氨基酸合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。芳香族氨基酸生物合成上調(diào)是否有利于增強(qiáng)病原菌YM15的致病性及其在水稻內(nèi)的生存能力有待進(jìn)一步探究。

基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，以未經(jīng)吩嗪化合物處理為對照，挑選經(jīng)吩嗪化合物處理后上下調(diào)明顯的基因進(jìn)行基因突變并驗(yàn)證其功能，并明確Myxin作用于Xoc YM15的作用靶點(diǎn)。

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