TasHSP16.9參與茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的小麥白粉病抗性

摘要：小分子熱激蛋白（sHSP）是一類結(jié)構(gòu)保守且受逆境脅迫誘導(dǎo)合成的應(yīng)激蛋白。筆者所在課題組前期發(fā)現(xiàn)TasHSP16.9受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，為明確該基因?qū)Σ≡锏膽?yīng)答反應(yīng)。本研究利用熒光定量RT-PCR分析小麥TasHSP16.9基因?qū)岳蛩峒柞ィ∕eJA）和白粉菌的應(yīng)答響應(yīng)，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對(duì)小麥白粉病抗性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeJA和白粉菌均可誘導(dǎo)TasHSP16.9基因表達(dá)；TasHSP16.9基因沉默促進(jìn)了白粉菌菌絲生長(zhǎng)，表明TasHSP16.9基因可能參與了JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的小麥白粉病抗性防御。

關(guān)鍵詞：小麥；sHSP16.9；茉莉酸；病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）；白粉病抗性

中圖分類號(hào)：S435.121.4+6" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0030-04

收稿日期：2023-12-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32360484）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：22B210008）；蘭州交通大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：CXXL20220035）。

作者簡(jiǎn)介：李靜婷（1983—），女，內(nèi)蒙古包頭人，博士，副教授，主要從事小麥遺傳育種學(xué)研究。E-mail：jingting_lee@163.com。

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物，小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的提升關(guān)乎國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活質(zhì)量。環(huán)境脅迫（高溫及干熱風(fēng)、低溫冷害及霜凍、干旱）和生物脅迫（赤霉病、條銹病、白粉病等病害）嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。2023年全國(guó)小麥白粉病預(yù)計(jì)發(fā)生面積高達(dá)600萬(wàn)hm2（https：//www.natesc.org.cn）。雖然，已在小麥及其近緣種屬中近66個(gè)位點(diǎn)定位了100多個(gè)抗白粉病基因，但是大多數(shù)未進(jìn)行深入的功能研究^［1］。因此，解析小麥白粉病抗性遺傳機(jī)制對(duì)于抗病育種具有重要意義。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種模式植物和農(nóng)作物基因功能研究中，這項(xiàng)技術(shù)在小麥抗條銹病、白粉病、紋枯病等抗病相關(guān)基因功能研究方面取得重要研究成果^［2］。利用BSMV-VIGS技術(shù)沉默蛋白激酶基因TaPiPK1、TaPK3A來(lái)研究其功能，發(fā)現(xiàn)沉默TaPiPK1、TaPK3A基因降低了小麥對(duì)條銹菌、禾谷絲核菌的抗性，推測(cè)其參與小麥條銹病、紋枯病抗性防御^［3-4］。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和基因克隆新技術(shù)新方法的不斷涌現(xiàn)，抗病相關(guān)的候選基因挖掘會(huì)越來(lái)越多，候選基因功能驗(yàn)證將是未來(lái)研究重點(diǎn)，VIGS技術(shù)將會(huì)在禾本科植物的基因功能研究中發(fā)揮更大的作用。

小分子熱激蛋白（sHSP）在正常條件下不表達(dá)或表達(dá)量很低，高溫、鹽脅迫、干旱等非生物脅迫均會(huì)誘導(dǎo)sHSP表達(dá)^［5-7］。此外，sHSP也可被茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）誘導(dǎo)表達(dá)，參與植物的抗病防御反應(yīng)，如草莓HSP17.4介導(dǎo)水楊酸與茉莉酸互作調(diào)控草莓炭疽病抗性^［8］。研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸（JA）可誘導(dǎo)小麥、水稻提高對(duì)赤霉病、白粉病、紋枯病的抗性，JA 是病原物誘導(dǎo)小麥防御基因表達(dá)的信號(hào)分子^［9-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，TasHSP16.9啟動(dòng)子含有MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件（Box-W1），推測(cè)TasHSP16.9參與了小麥抗病防御響應(yīng)。本研究利用熒光定量RT-PCR分析小麥TasHSP16.9基因?qū)eJA和白粉菌的應(yīng)答響應(yīng)，利用VIGS技術(shù)分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對(duì)小麥白粉病抗性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥品種復(fù)壯30（攜帶抗白粉病基因Pm5e）^［12］由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所劉志勇研究員惠贈(zèng)。煙草采用本生煙品種。經(jīng)過(guò)修飾的大麥條紋花葉病毒（BSMV）的VIGS系統(tǒng)、農(nóng)桿菌菌株EHA105由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院李大偉教授惠贈(zèng)。小麥白粉菌E09菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李洪杰研究員惠贈(zèng)。試驗(yàn)中所需引物由北京賽百盛生物工程有限責(zé)任公司合成，Trizol試劑、TIANScript Ⅱ RT Kit等試劑盒從天根生化科技（北京）有限公司購(gòu)得，MeJA購(gòu)自Sigma公司。所有試驗(yàn)于2023年3—9月在蘭州交通大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白粉菌侵染生物脅迫

選取籽粒飽滿的復(fù)壯30種子種植于盛有營(yíng)養(yǎng)土的小缽中，置于光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，光照16 h，溫度22 ℃，黑暗8 h，溫度18 ℃，相對(duì)濕度60%。待小麥長(zhǎng)至2葉期時(shí)，利用白粉菌E09菌株接種2葉期小麥，并于接種后1、3、6、12、24 h時(shí)取樣。同時(shí)，接種14 d后，按照0～4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查植株的抗病性，以感白粉病小麥品種農(nóng)大015為感病對(duì)照^［13］。

1.2.2 茉莉酸甲酯處理

利用1.0 mmol/L的MeJA溶液（用含0.2%Tween的蒸餾水配成濃度10 mmol/L的溶液）噴灑于2葉期小麥復(fù)壯30第1張葉，并在MeJA處理后0、1、3、6、12、24 h時(shí)取第1張葉。

1.2.3 TasHSP16.9基因表達(dá)譜分析

利用Trizol試劑法提取小麥葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈作為模版，利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)TasHSP16.9基因表達(dá)，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，38個(gè)循環(huán)。參見(jiàn)李靜婷等的方法^［14］進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.2.4 VIGS侵染煙草和小麥

利用PCR擴(kuò)增克隆TasHSP16.9基因的3′UTR區(qū)域特異性片段插入到大麥條紋花葉病毒（BSMV）的γ亞基γb序列后構(gòu)建重組病毒沉默載體BMSV：TasHSP。用BSMV：α、BSMV：β、BMSV：rblzc（空載體為對(duì)照）、BMSV：PDS、BMSV：TasHSP分別接種含有Kan、Rif 的LB液體培養(yǎng)基（50 mmol/L MES、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮），28 ℃培養(yǎng)至吸光度D600 nm為0.5～1.0。將BSMV：α、BSMV：β分別與BMSV：rblzc、BMSV：PDS（沉默小麥內(nèi)源八氫番茄紅素脫氫酶基因Pds，作為VIGS體系的指示基因）、BMSV： TasHSP等體積混合，離心后將沉淀重懸于50 mL侵染緩沖液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES、10 mmol/L 乙酰丁香酮）。然后分別接種6株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草，用注射器將侵染液注射于幼嫩葉片繁殖病毒，7 d后取有病毒表型的煙草葉片，研磨成汁液，涂擦于生長(zhǎng)8 d的2葉期小麥復(fù)壯30的葉片表面，10 d后觀察第3張葉的病毒感染表型，以轉(zhuǎn)染BMSV：PDS病毒的小麥第3張葉葉基部白化作為病毒沉默系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率的指示。

1.2.5 內(nèi)源基因沉默檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染空病毒BMSV：rblzc和BMSV： TasHSP的小麥復(fù)壯30且出現(xiàn)黃化病狀的葉片，進(jìn)而提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用半定量RT-PCR法檢測(cè)內(nèi)源TasHSP16.9基因表達(dá)（表1），檢測(cè)內(nèi)源基因是否沉默。

1.2.6 離體觀察

取轉(zhuǎn)染空病毒BMSV：rblzc和BMSV： TasHSP的小麥復(fù)壯30出現(xiàn)黃化病狀的葉片葉尖和葉中部，置于0.8%瓊脂培養(yǎng)基（加保綠劑苯胼咪唑0.6%），接白粉菌后3 d開(kāi)始顯微鏡（40×）觀察離體葉片白粉菌菌絲生長(zhǎng)情況。利用脫色劑（75%乙醇、25%三氯甲烷和0.3%三氯乙酸）65 ℃處理過(guò)夜，再利用染色液（0.6%考馬斯亮藍(lán)與015%三氯乙酸等體積混合）染色5～10 min，置于保存液（75%水、20%甘油和5%乙酸）中備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA與白粉菌侵染后復(fù)壯30中TasHSP16.9基因的表達(dá)模式

本研究前期已克隆了TasHSP16.9基因，對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用調(diào)控元件分析發(fā)現(xiàn)，TasHSP16.9啟動(dòng)子含有MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件（Box-W1）（表2），推測(cè)TasHSP16.9參與了植物抗病防御響應(yīng)。為明確TasHSP16.9對(duì)白粉菌誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，采用熒光定量 RT-PCR方法分析MeJA處理及白粉菌E09侵染后復(fù)壯30幼苗中TasHSP16.9的表達(dá)。

利用白粉菌E09菌株苗期接種復(fù)壯30、農(nóng)大015鑒定其白粉病抗性水平，發(fā)現(xiàn)復(fù)壯30表現(xiàn)為高抗或免疫，葉尖表現(xiàn)為過(guò)敏性壞死（IT＝0），農(nóng)大015表現(xiàn)高感（IT＝4）（圖1）。

由圖2可知，MeJA處理后1～6 h TasHSP16.9表達(dá)量逐漸升高，6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，外源MeJA在葉片內(nèi)的濃度逐漸下降，該基因表達(dá)水平也逐漸下降。白粉菌接種后1～6 h TasHSP16.9表達(dá)量很低，沒(méi)有明顯變化，12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。表明MeJA和白粉菌均可以誘導(dǎo)TasHSP16.9的表達(dá)。推測(cè)TasHSP16.9是茉莉酸（JA）信號(hào)途徑下游的防御基因，外源噴施MeJA激活其表達(dá)。而JA是小麥抗白粉病的信號(hào)分子，白粉菌侵染小麥后誘導(dǎo)內(nèi)源JA水平升高，激活下游TasHSP16.9表達(dá)。所以該基因?qū)Π追劬捻憫?yīng)較外源MeJA緩慢。進(jìn)而推測(cè)TasHSP16.9參與了JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的小麥白粉病抗性防御。

2.2 內(nèi)源基因沉默效果

由于小麥復(fù)壯30對(duì)白粉菌E09表現(xiàn)高抗或免疫，所以選取小麥復(fù)壯30為試驗(yàn)材料進(jìn)行病毒侵染?？寺asHSP16.9基因的3′UTR區(qū)域特異性片段插入到大麥條紋花葉病毒（BSMV）的γ亞基γb序列后構(gòu)建重組病毒沉默載體BMSV：TasHSP（圖 3-A）。病毒接種10 d后，取有病毒表型的小麥葉片對(duì)內(nèi)源基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。與空載體BMSV：rblzc相比，BMSV：TasHSP轉(zhuǎn)染的小麥葉片TasHSP16.9基因表達(dá)量下調(diào)，表明接種病毒后，復(fù)壯30葉片中TasHSP16.9基因被瞬時(shí)沉默（圖3-B）。

2.3 接種病毒后復(fù)壯30對(duì)白粉病菌的抗性

小麥復(fù)壯30接種病毒10 d后，取有病毒表型的小麥葉片接種白粉菌E09進(jìn)行離體觀察。結(jié)果顯示，在白粉菌E09侵染后7 d，轉(zhuǎn)染病毒BMSV：TasHSP較空病毒BMSV：rblzc葉片中菌絲形成更大更密集的網(wǎng)狀，表明沉默TasHSP16.9基因促進(jìn)了白粉菌菌絲生長(zhǎng)（圖4）。TasHSP16.9可能參與了小麥白粉病抗性防御。

3 討論與結(jié)論

橡樹(shù)HbHSP90.8-1基因受白粉菌、外源MeJA和SA的誘導(dǎo)表達(dá)，表明其參與了橡樹(shù)白粉病抗病防御及抗病相關(guān)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑^［15］。Hsp90是一類受腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）調(diào)節(jié)的同源二聚體熱激蛋白。熱激蛋白是一類可被環(huán)境脅迫誘導(dǎo)并參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程的蛋白家族，其中含量最豐富的是小分子熱激蛋白sHSP。

很多研究表明，非生物脅迫可誘導(dǎo)sHSP的產(chǎn)生，本研究前期結(jié)果表明，TasHSP16.9受高溫、低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表明TasHSP16.9基因可能在小麥抵抗非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用^{［5-7，14］}。而且TasHSP16.9啟動(dòng)子含有MeJA響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件（Box-W1），所以TasHSP16.9也可能參與了植物抗病防御反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA和白粉菌E09均可誘導(dǎo)TasHSP16.9基因表達(dá)。已有研究表明，MeJA可誘導(dǎo)提高小麥對(duì)白粉病的抗性，JA是誘導(dǎo)小麥抗白粉病的信號(hào)分子，所以推測(cè)TasHSP16.9參與了JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的小麥白粉病抗性防御^［11］。

VIGS是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單和高效的特點(diǎn)，而小麥品種復(fù)壯30對(duì)我國(guó)流行的白粉病生理小種表現(xiàn)為高抗或免疫，所以本研究以復(fù)壯30為材料利用VIGS技術(shù)分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對(duì)小麥白粉病抗性的影響^［12］。利用VIGS技術(shù)介導(dǎo)TasHSP16.9沉默促進(jìn)了白粉菌菌絲生長(zhǎng)，表明TasHSP16.9可能參與了小麥抗白粉病防御。后續(xù)將通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析及利用酵母雙雜交篩選TasHSP16.9的互作蛋白，以明確該基因在小麥抗病信號(hào)通路中的調(diào)控功能，為小麥抗病育種提供理論參考。

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