丙戊酸鈉促進(jìn)神經(jīng)根回植術(shù)后神經(jīng)元存活的機(jī)制研究

吳殿秀,袁依然,楊麗娟,王海鵬

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132011)

臂叢根性撕脫傷是上肢致殘率較高的一種損傷,撕脫的范圍可以是一個(gè)、多個(gè)甚至是全部臂叢,由于軸突接近胞體撕裂,可導(dǎo)致神經(jīng)胞體的大量死亡[1]。為代替死亡神經(jīng)元的功能,NANDHANA M等[2]通過(guò)肋間神經(jīng)和副神經(jīng)等移位、游離及移植肌肉,恢復(fù)和重建了部分肢體功能,但手術(shù)過(guò)程不可避免地犧牲部分組織供區(qū)功能,而且術(shù)后功能恢復(fù)并不理想,目前,在脊髓水平上的神經(jīng)修復(fù)-神經(jīng)根回植術(shù)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。CHAI H[3]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)神經(jīng)根回植術(shù)不但能增加神經(jīng)元存活率,而且存活下來(lái)神經(jīng)元80%以上會(huì)再生出軸突長(zhǎng)入回植的神經(jīng)根。

丙戊酸鈉是一種不含氮的廣譜情緒穩(wěn)定劑,應(yīng)用于臨床上治療癲癇已有30多年的歷史。有研究[4-5]表明,丙戊酸鈉不僅具有保護(hù)神經(jīng)元的作用,而且還可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)在大鼠臂叢神經(jīng)撕脫傷的基礎(chǔ)上給予神經(jīng)根回植術(shù)治療,通過(guò)是否服用丙戊酸鈉,比較單一手術(shù)治療與手術(shù)聯(lián)合藥物治療對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的差別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)155只,體質(zhì)量200～250 g;將大鼠隨機(jī)分為空白組(5只)、手術(shù)組(75只)、丙戊酸組(75只);手術(shù)組和丙戊酸鈉組按照術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)分為1、2、3、7、14 d 5個(gè)亞組,每個(gè)亞組15只。

主要試劑:TUNEL試劑盒(羅氏公司,瑞士);Bcl-2抗體(Abcam公司,英國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR SYBR Green Master,ROX公司,瑞士);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV,Fermentas公司,英國(guó));總RNA提取試劑盒(PolyA Ttract?mRNA Isolation System Ⅲ Promega,Madison,MA,Promega公司,美國(guó));蛋白質(zhì)電泳分子量Marker(Takara公司,日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

模型制備:應(yīng)用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g)對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉,將大鼠俯臥位固定于無(wú)菌手術(shù)操作臺(tái)上,剃毛器剔除頸后及上背部鼠毛,常規(guī)消毒。以C6為中心,取頸背部后正中長(zhǎng)約3 cm切口,以突出的T2棘突為定位標(biāo)志(棘突最高),將肌肉組織向兩側(cè)牽開(kāi),顯露C5、C6椎板,咬除相應(yīng)棘突和右側(cè)半椎板,顯露脊髓及C6神經(jīng)根。將銳利刀片靠近脊髓,小心切斷神經(jīng)根,再用刀片作約3 mm深脊髓橫行切口,將C6神經(jīng)前根回植入脊髓前角,無(wú)創(chuàng)縫線縫合2針固定,后根曠置,縫合切口,待動(dòng)物清醒后分籠飼養(yǎng)。丙戊酸組大鼠術(shù)后用丙戊酸鈉300 mg/(kg·d)的水代替正常飲水飼養(yǎng)。

取材:隨機(jī)選取10只大鼠,麻醉后,雙側(cè)眼球摘除法放血處死,取手術(shù)側(cè)C6節(jié)段脊髓,-80 ℃冷凍保存(5只用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),5只用于Western blot檢測(cè))。剩余5只大鼠用肝素鹽水混合物(肝素12 500 U+100 mL生理鹽水)灌注、沖洗組織血管里的血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。切取C6節(jié)段脊髓,浸于4%多聚甲醛緩沖液固定,脫水后用石蠟包埋,制作厚度約為3 μm的連續(xù)橫斷切片(用于TUNEL檢測(cè))?？瞻讓?duì)照組5只大鼠按照PCR檢測(cè)要求進(jìn)行取材。

TUNEL法檢測(cè):按照試劑盒說(shuō)明染色后在200倍顯微鏡下觀察,神經(jīng)核染為棕黃色的判定為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)右側(cè)(手術(shù)側(cè))陽(yáng)性的神經(jīng)元,計(jì)數(shù)左側(cè)(正常)胞體清晰、蘇木精染成藍(lán)色胞核神經(jīng)元。凋亡神經(jīng)元百分比為右側(cè)凋亡神經(jīng)元數(shù)目與左側(cè)正常神經(jīng)元數(shù)目的比值。

Western blot檢測(cè):提取大鼠脊髓中的蛋白質(zhì),檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量。通過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗原抗體反應(yīng)后進(jìn)行顯色、曝光,最后將獲得的膠片進(jìn)行凝膠圖像分析。將膠片進(jìn)行掃描或者拍照,用圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值,與內(nèi)參灰度值的比值作為表達(dá)指數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):提取出大鼠脊髓總RNA后,定量RNA濃度與純度,根據(jù)試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,并以其為熒光定量模板(引物見(jiàn)表1),用Applied Biosystems熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)含量。

表1 PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元凋亡情況

本研究結(jié)果顯示,神經(jīng)根回植術(shù)后第1、2天各組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)凋亡神經(jīng)元,術(shù)后第3～14天手術(shù)組與丙戊酸組有凋亡神經(jīng)元存在。在第3、7天丙戊酸鈉組凋亡的神經(jīng)元百分率低于手術(shù)組(P<0.05),而在第14天兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 神經(jīng)元凋亡百分率

2.2 Bcl-2的蛋白表達(dá)情況

本研究結(jié)果顯示,神經(jīng)根回植術(shù)后,手術(shù)組與丙戊酸鈉組Bcl-2的蛋白表達(dá)逐漸升高,第7天后表達(dá)降低。丙戊酸鈉組較手術(shù)組Bcl-2的蛋白表達(dá)在術(shù)后第2、3、7天均明顯升高(P<0.05),但術(shù)后第1、14天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 TUNEL 染色凋亡神經(jīng)元Fig.1 Apoptotic of neurons detected by TUNEL

表3 Bcl-2 Western blotting 條帶IOD標(biāo)準(zhǔn)化值

2.3 Bcl-2的mRNA 表達(dá)情況

本研究結(jié)果顯示,神經(jīng)根回植術(shù)后手術(shù)組與丙戊酸鈉組Bcl-2的mRNA 表達(dá)逐漸增高,第7天后的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。丙戊酸鈉組較手術(shù)組Bcl-2的mRNA表達(dá)在術(shù)后第2、3、7 天明顯增高(P<0.05),術(shù)后第1、14天mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 Bcl-2 Western blotting條帶Fig.2 Bcl-2 Western blotting bands

表4 Bcl-2 的mRNA表達(dá)

3 討 論

臂叢根性撕脫傷雖不會(huì)危及生命,但可引起上肢嚴(yán)重傷殘。傷后治療是迄今為止國(guó)內(nèi)外手外科、神經(jīng)外科的難題之一。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,神經(jīng)移位術(shù)、肌肉關(guān)節(jié)功能重建等多種治療方法被應(yīng)用于臨床[6-7],但由于受可供移植和轉(zhuǎn)位的神經(jīng)有限、移位神經(jīng)后大腦功能重塑及供區(qū)功能受損等多種原因影響,術(shù)后肢體功能恢復(fù)難以達(dá)到滿意效果。有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn),節(jié)前根性撕脫傷的損傷位置由于更接近胞體,導(dǎo)致脊髓內(nèi)部大量神經(jīng)元死亡,所以單純修復(fù)術(shù)后神經(jīng)纖維失去了“原動(dòng)力”再生,損傷較重者根本無(wú)法再修復(fù)。CHAI H 等[3]發(fā)現(xiàn),臂叢根性撕脫傷后應(yīng)用神經(jīng)根回植術(shù)可以減緩傷側(cè)肌肉萎縮,增加肌纖維橫截面積,恢復(fù)肌肉電生理學(xué)特征。HOANG T X等[9]發(fā)現(xiàn)單個(gè)神經(jīng)根回植可以促進(jìn)多個(gè)脊髓損傷節(jié)段內(nèi)的神經(jīng)元存活。HTUT M等[10]將神經(jīng)根回植手術(shù)應(yīng)用于臨床治療,證實(shí)神經(jīng)根回植術(shù)可以有效地保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,并促進(jìn)神經(jīng)纖維再生,但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。有研究[4,11]發(fā)現(xiàn),小分子物質(zhì)丙戊酸鈉可以通過(guò)血腦屏障直接到達(dá)損傷處保護(hù)臂叢根性撕脫傷后的神經(jīng)元。本試驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)根回植術(shù)聯(lián)合應(yīng)用丙戊酸鈉即手術(shù)聯(lián)合藥物的方法治療神經(jīng)根撕脫傷,通過(guò)TUNEL染色證實(shí)丙戊酸鈉可以在神經(jīng)根回植術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步減少神經(jīng)元的凋亡。

Bcl-2是公認(rèn)的具有強(qiáng)大抑制凋亡作用的基因,它可以通過(guò)抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)釋放、調(diào)節(jié)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的再次分布及濃度波動(dòng)、抑制線粒體釋放元色素C而減少神經(jīng)元凋亡[12],也可以通過(guò)抑制第二種線粒體來(lái)源的激活劑或低等電點(diǎn)IAP結(jié)合蛋白保護(hù)神經(jīng)元免受自由基侵害的作用。NATSUME A等[13]發(fā)現(xiàn),L4-6根性撕脫傷大鼠Bcl-2可有效增加脊髓前角神經(jīng)元存活數(shù)量,YUAN P X[14]發(fā)現(xiàn),丙戊酸可以通過(guò)增加Bcl-2和GAP-43的表達(dá)保護(hù)神經(jīng)元。本試驗(yàn)通過(guò)Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,臂叢撕脫傷后應(yīng)用丙戊酸會(huì)誘導(dǎo)Bcl-2的蛋白及mRNA表達(dá)增加,同理可推斷丙戊酸可以通過(guò)增加脊髓內(nèi)Bcl-2的基因表達(dá)來(lái)抑制神經(jīng)元的凋亡,從而促進(jìn)受損神經(jīng)元的存活。

綜上所述,在大鼠臂叢根性撕脫傷后早期進(jìn)行神經(jīng)根回植聯(lián)合丙戊酸鈉治療,可增加Bcl-2的蛋白及mRNA表達(dá),有利于損傷神經(jīng)元的存活,本研究可為后期臂叢根性撕脫傷的臨床治療提供新的思路和方法。