氨對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)及稚蚌的急性毒性

喬瑞婷 李 艷 劉 苗 趙永晶 舒鳳月 崔永德

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3.曲阜師范大學(xué), 曲阜 273165)

氨氮是水生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的污染物, 其濃度過(guò)高時(shí)可對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用[1]。人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生的外源氮是水中氮污染的主要來(lái)源[2], 如過(guò)度使用的農(nóng)田氮肥隨地表徑流進(jìn)入水體。近年來(lái)我國(guó)氮肥消耗量一直維持在較高水平, 且呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[3]。隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展, 氮污染已經(jīng)成為世界各地水體污染的重要問(wèn)題之一。確定氨氮對(duì)生物的毒性效應(yīng)及閾值是管理水體氨氮濃度的重要依據(jù)。

底棲動(dòng)物是水生態(tài)系統(tǒng)中的一大類(lèi)群, 其活動(dòng)能力弱, 逃逸能力差, 對(duì)環(huán)境污染和水質(zhì)的干擾極為敏感[15,16], 能較好地反映出水體中受污染情況。蚌類(lèi)屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 蚌目(Unionoida), 蚌科(Unionidae), 作為典型的大型底棲動(dòng)物, 其生活史復(fù)雜且壽命較長(zhǎng)[17—19], 且相較于魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)而言對(duì)氨更敏感[20]。自然界中絕大多數(shù)蚌類(lèi)的生活史存在一個(gè)寄生的過(guò)程, 在繁殖季節(jié)鉤介幼蟲(chóng)從成熟母蚌的外鰓排出, 寄生在魚(yú)體鰓絲、魚(yú)鰭上, 完成變態(tài)發(fā)育成為稚蚌后從魚(yú)體脫落,沉入水底, 營(yíng)底棲生活[21—23]。蚌類(lèi)各生活史階段有較為明顯的區(qū)分, 同時(shí)鉤介幼蟲(chóng)和稚蚌相較于幼蚌未發(fā)育完全, 可能對(duì)毒物更為敏感。因此, 蚌類(lèi)是毒性物質(zhì)測(cè)試和水質(zhì)狀況評(píng)價(jià)的理想對(duì)象, 然而以往對(duì)于蚌類(lèi)的研究主要集中于幼蚌, 對(duì)更早期生活史階段如鉤介幼蟲(chóng)、稚蚌的研究則較少[24]。

本文以長(zhǎng)江中下游常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)蚌種褶紋冠蚌(Cristaria plicata)為研究對(duì)象, 分別以其鉤介幼蟲(chóng)和稚蚌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開(kāi)展氨氮急性毒性實(shí)驗(yàn), 探究氨氮對(duì)褶紋冠蚌早期生活史階段的毒性, 以期為蚌類(lèi)保護(hù)及水體中氮管理提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)選擇長(zhǎng)江中下游常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)蚌種褶紋冠蚌為研究對(duì)象。孕有鉤介幼蟲(chóng)的母蚌、稚蚌及幼蚌均取自安徽水韻軟體動(dòng)物繁育科技有限公司。母蚌從養(yǎng)殖池塘中取出后, 用軟毛刷將母蚌表面附著的著生藻清理干凈, 將其放于盛有水的容器中,水深保持可以露出殼頂?shù)母叨?。將母蚌置于陰涼的環(huán)境中待其自然釋放出鉤介幼蟲(chóng), 在顯微鏡下觀察鉤介幼蟲(chóng)的活性, 挑選活力良好的鉤介幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)在鉤介幼蟲(chóng)釋放后2h內(nèi)進(jìn)行。

稚蚌是指鉤介幼蟲(chóng)寄生在魚(yú)鰓上發(fā)育基本成熟后脫落的個(gè)體, 實(shí)驗(yàn)選擇5日齡的稚蚌為急性毒性實(shí)驗(yàn)材料。在解剖鏡下挑選活力良好的稚蚌(伸出斧足活動(dòng))為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

鉤介幼蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)試驗(yàn)材料學(xué)會(huì)(American Society for Testing Material, ASTM) 發(fā)表的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn), 采用24h靜水水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法, 實(shí)驗(yàn)在250 mL燒杯中進(jìn)行, 為便于觀察先將鉤介幼蟲(chóng)置于90 mm培養(yǎng)皿中再置于盛有實(shí)驗(yàn)水的燒杯中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。光照周期為12L∶12D。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)充分曝氣的重組水[25]。用分析純NH4Cl配制實(shí)驗(yàn)所需的氨溶液母液, 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定24h未見(jiàn)死亡的最大氨氮濃度和全部死亡的最小氨氮濃度。再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以等間距設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的6組氨氮濃度, 總氨氮濃度(TAN, 以N計(jì))分別為: 0(對(duì)照組)、12、24、36、48和60 mg/L。每組氨氮濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在恒溫水浴缸中進(jìn)行, 以維持水溫在(20.0±0.2)℃, 用NaOH稀溶液和HCl稀溶液來(lái)調(diào)節(jié)水體pH在7.5±0.1。每個(gè)燒杯中放置10只鉤介幼蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)的死亡率, 用鑷子將盛有幼蟲(chóng)的培養(yǎng)皿取出, 用飽和NaCl溶液測(cè)試其存活狀況。在解剖鏡下先統(tǒng)計(jì)鉤介幼蟲(chóng)閉殼數(shù)記為N0, 滴加飽和NaCl溶液后再次統(tǒng)計(jì)閉殼數(shù)N1, 總死亡數(shù)N=10-(N1-N0)[26]。

稚蚌急性毒性實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)試驗(yàn)材料學(xué)會(huì)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn), 采用48h靜水水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定48h未見(jiàn)死亡的最大氨氮濃度和全部死亡的最小氨氮濃度。再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以等間距設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的6組氨氮濃度, TAN分別為: 0(對(duì)照組)、24、36、48、60和72 mg/L。其他設(shè)置同鉤介幼蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后24h檢查稚蚌的存活情況, 用鑷子將盛有稚蚌的培養(yǎng)皿取出, 在解剖鏡下觀察稚蚌的存活情況, 雙殼打開(kāi)輕觸不閉殼或雙殼緊閉輕觸有白色絮狀物視為死亡, 記錄總死亡數(shù)N。實(shí)驗(yàn)期間, 每天更換1/2的實(shí)驗(yàn)水。

1.3 樣品采集與分析

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后在每天換水前監(jiān)測(cè)1次水溫、pH、溶氧等, 使用多參數(shù)水質(zhì)分析儀PRO Plus (Yellow Spring Instruments, 美國(guó))于水體中部測(cè)定。并取25 mL水樣用于檢測(cè)水體氨氮含量, 檢測(cè)方法使用納氏試劑光度法測(cè)定[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理與計(jì)算使用Excel 2016完成, 圖形繪制使用Origin 2021完成。

死亡率計(jì)算公式: 死亡率(%)=死亡數(shù)/10×100

為便于比較, 將所有實(shí)驗(yàn)的TAN濃度結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為在水溫20℃、pH 7條件下(TAN7.0,20℃)的值(AVpH7), 計(jì)算公式如下:

分子氨的計(jì)算公式:

式中, pKa=0.09018+2729.92/T

式中,T為絕對(duì)溫度,T=273.15+t(℃), 其中NH3為分子氨,為離子氨。

TAN與死亡率的效應(yīng)-濃度曲線選擇各組不同時(shí)間采集計(jì)算的AVpH7平均值作為T(mén)AN值, NH3-N與死亡率的效應(yīng)-濃度曲線選用如上計(jì)算的NH3-N的平均值。半致死濃度LC50通過(guò)將死亡率=50%代入濃度效應(yīng)曲線公式獲得。

2 結(jié)果

2.1 氨對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)的急性毒性

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)際水溫為(20.1±0.8)℃ (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, mean±SD), 實(shí)際pH為7.67±0.2。在24h內(nèi)各處理組平均TAN7.0,20℃濃度依次為(1±0)、(34±1)、(63±2)、(83±1)、(94±2)和(118±8) mg/L。各處理組平均NH3-N濃度依次為(0.01±0.01)、(0.30±0.17)、(0.53±0.24)、(0.65±0.19)、(0.75±0.13)和(0.92±0.13) mg/L (圖1)。

圖1 褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)水體理化指標(biāo)Fig.1 Physical and chemical indexes of water in acute toxicity test of glochidia

如圖2顯示, 隨著NH3-N濃度的升高, 褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)的死亡率是明顯升高的。在各處理組中,24h鉤介幼蟲(chóng)死亡率依次為0、3%、35%、47%、67%和100%。氨氮對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)的24h LC50為0.63 mg NH3-N/L和78 mg TAN7.0,20℃/L。

圖2 TAN及NH3-N對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)的濃度-效應(yīng)曲線Fig.2 Scatter plot of liner regression between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) to mortality of glochidia

2.2 氨對(duì)褶紋冠蚌稚蚌的急性毒性

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)際水溫為(19.2±0.7)℃, 實(shí)際pH為7.62±0.18。48h內(nèi)各處理組平均TAN7.0,20℃濃度依次為(2±0)、(64±3)、(89±3)、(114±7)、(134±0)和(157±2) mg/L; 各處理組平均NH3-N濃度依次為(0.01±0.01)、(0.39±0.14)、(0.53±0.11)、(0.65±0.07)、(0.75±0.08)和(0.84±0.09) mg/L (圖3)。

圖3 褶紋冠蚌稚蚌急性毒性實(shí)驗(yàn)水體理化指標(biāo)Fig.3 Physical and chemical indexes of water in acute toxicity test of newly transformed juvenile

如圖4顯示, 隨著NH3-N濃度的升高, 褶紋冠蚌稚蚌的死亡率逐漸升高。在各處理組中, 48h稚蚌的死亡率依次為0、10%、23%、67%、93%和100%。通過(guò)計(jì)算得到氨氮對(duì)褶紋冠蚌稚蚌的48h LC50為0.60 mg NH3-N/L和104 mg TAN7.0,20℃/L; 氨氮對(duì)褶紋冠蚌稚蚌的24h LC50介于0.64—0.78 mg NH3-N/L和118—140 mg TAN7.0,20℃/L 。

圖4 TAN及NH3-N對(duì)褶紋冠蚌稚蚌的濃度-效應(yīng)曲線Fig.4 Scatter plot of liner regression between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) to mortality of newly transformed juvenile

3 討論

3.1 氨對(duì)褶紋冠蚌早期生活史階段的毒性

本研究中氨氮對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)的24h LC50為0.63 mg NH3-N/L和78 mg TAN/L, 對(duì)褶紋冠蚌稚蚌的48h LC50為0.60 mg NH3-N/L和104 mg TAN/L。這些閾值高于許多國(guó)內(nèi)外已有研究中氨對(duì)其他淡水蚌類(lèi)毒性的閾值, 如氨對(duì)Lampsilis siliquoidea、Actinonaias ligamentina、Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris、Lampsilis fasciola等蚌類(lèi)鉤介幼蟲(chóng)的24h LC50為4.8—16 mg TAN/L[26,28], 對(duì)Lampsilis siliquoidea、Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris等蚌類(lèi)稚蚌48h LC50為7.9—16 mg TAN/L[26,28]。上述結(jié)果表明相比其他淡水蚌類(lèi), 褶紋冠蚌能夠耐受更高濃度的氨氮。近些年來(lái)長(zhǎng)江中下游水體總氮含量達(dá)多年前的十倍之多, 楔形麗蚌(Lamprotula bazini)、三巨瘤麗蚌(Lamprotula triclava)等不少種類(lèi)消失, 而褶紋冠蚌始終為該研究區(qū)域的優(yōu)勢(shì)種之一[29,30], 暗示褶紋冠蚌對(duì)環(huán)境變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。此外, 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有關(guān)于蚌類(lèi)氨氮耐受性的研究大多聚焦于珍稀物種或?yàn)l危物種, 這些蚌類(lèi)自身對(duì)環(huán)境的變化較為敏感[31], 對(duì)污染物的耐受能力較差, 這可能也是導(dǎo)致本研究結(jié)果與已有報(bào)道差異的原因之一。

3.2 褶紋冠蚌不同生活史階段氨耐受性的差異及機(jī)制

本研究結(jié)果顯示褶紋冠蚌早期生活史階段對(duì)氨氮更為敏感, 且隨著個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的持續(xù)其對(duì)氨的耐受性增加。本研究中稚蚌的24h LC50(以總氨氮計(jì))約為鉤介幼蟲(chóng)的1.5倍, 表明相比鉤介幼蟲(chóng), 稚蚌能夠耐受更高濃度的氨氮。關(guān)于褶紋冠蚌幼蚌,國(guó)內(nèi)已有部分學(xué)者研究了氨對(duì)其毒性, 如陳瑩瑩等[32]發(fā)現(xiàn)氨氮對(duì)褶紋冠蚌幼蚌的48h LC50為274 mg TAN/L, 其值亦遠(yuǎn)高于本研究氨對(duì)稚蚌和鉤介幼蟲(chóng)的LC50, 同樣表明隨著蚌個(gè)體發(fā)育的完善, 其對(duì)氨毒性耐受性增強(qiáng)。Wang 等[26]對(duì)北美一種淡水蚌類(lèi)Lampsilis siliquoidea的研究結(jié)果與本研究類(lèi)似, 氨對(duì)Lampsilis siliquoidea稚蚌的48h EC50(＞16 mg TAN/L)高于其對(duì)鉤介幼蟲(chóng)的48h EC50(8.8—13 mg TAN/L)。關(guān)于Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris、Lampsilis fasciola等淡水蚌類(lèi)的研究結(jié)果同樣與本研究類(lèi)似[28,33]。

蚌類(lèi)發(fā)育后期其外殼較早期明顯變厚, 與鉤介幼蟲(chóng)相比能更有效地阻隔體內(nèi)組織與水體氨氮的接觸, 從而利于其耐受更高濃度的氨。已有大量研究表明, 軟體動(dòng)物在處于危險(xiǎn)狀態(tài)時(shí), 外部的殼對(duì)其有一定的保護(hù)作用, 如銅銹環(huán)棱螺在面對(duì)氨脅迫時(shí)會(huì)緊閉厴甲來(lái)減少與外部水環(huán)境的接觸, 從而減弱了氨對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷[34]。而蚌類(lèi)的外殼在其早期生活史階段薄且易碎, 對(duì)殼內(nèi)組織的保護(hù)不夠充分。稚蚌及幼蚌由于外殼的加厚變硬及發(fā)育的完成, 可緊閉雙殼來(lái)減少體內(nèi)組織暴露于有毒環(huán)境的時(shí)間, 可以對(duì)稚蚌、幼蚌起到更有力的保護(hù)作用, 因而其比鉤介幼蟲(chóng)能耐受更高濃度的氨。

在一定范圍內(nèi), 蚌類(lèi)可以對(duì)氨氮進(jìn)行一定程度的解毒, 且其解毒能力也可能會(huì)隨著個(gè)體發(fā)育的完善有所提高。已有較多水生生物對(duì)氨解毒機(jī)制的研究表明鰓和肝胰臟(或肝臟、腎臟等)是其解毒的重要器官[35]。蚌類(lèi)可通過(guò)鰓上的纖毛組織將部分體內(nèi)的氨排出體外[36], 而隨著蚌類(lèi)個(gè)體發(fā)育, 鰓表面積變大, 其上的氨排泄速率會(huì)更高。蚌類(lèi)不同于鰓對(duì)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)排出作用, 蚌類(lèi)的肝胰臟主要是將生物體內(nèi)的氨轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒性的物質(zhì)儲(chǔ)存在體內(nèi)。在肝胰臟中銨可在催化酶的作用下生成谷氨酰胺(Gln)[37]、丙氨酸和天冬氨酸[38]。隨著個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育, 蚌類(lèi)的鰓和肝胰腺等解毒代謝器官的發(fā)育漸趨完善, 其解毒能力也逐漸增強(qiáng), 從而使其能夠耐受更高濃度的氨氮。

本研究仍有諸多不足, 首先研究對(duì)象僅為褶紋冠蚌1種, 關(guān)于氨氮對(duì)蚌類(lèi)毒性及閾值的評(píng)估仍需更多研究, 尤其是針對(duì)一些珍稀的亟待保護(hù)的種類(lèi),如背瘤麗蚌(Lamprotula leaii)、佛耳麗蚌(Lamprotula mansuyi)和三型矛蚌(Lanceolaria triformis)等。此外, 本研究?jī)H開(kāi)展了室內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn), 可能無(wú)法反映自然水體中蚌類(lèi)對(duì)長(zhǎng)期氨脅迫響應(yīng)。本研究團(tuán)隊(duì)前期針對(duì)鰱、鳙和鯽等魚(yú)類(lèi)、銅銹環(huán)棱螺等底棲動(dòng)物的研究表明氨對(duì)生物的毒性存在尺度依賴(lài)性, 其隨研究尺度的增大而減弱。因此,關(guān)于后期需結(jié)合多尺度研究系統(tǒng)分析氨對(duì)蚌類(lèi)的毒性效應(yīng)及閾值, 從而為自然水體中氨氮對(duì)蚌類(lèi)的安全閾值的確定及水體氮管理策略等提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示氨氮對(duì)褶紋冠蚌鉤介幼蟲(chóng)和稚蚌的LC50分別為0.63 mg NH3-N/L、78 mg TAN/L(24h)和0.60 mg NH3-N/L、104 mg TAN/L (48h), 這一結(jié)果表明褶紋冠蚌對(duì)氨氮的耐受性高于國(guó)內(nèi)外許多已有研究中的蚌種。此外, 褶紋冠蚌更早期生活史階段對(duì)氨氮更為敏感, 且隨著個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的持續(xù)其對(duì)氨的耐受性增加蚌類(lèi)。以上研究結(jié)果可為蚌類(lèi)保護(hù)及水體氮管理策略的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

圖版Ⅰ TAN及NH3-N 與褶紋冠蚌稚蚌的濃度-效應(yīng)關(guān)系PlateⅠ The relationship between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) of newly transformed juvenile

附表 S1 褶紋冠蚌稚蚌累計(jì)死亡個(gè)數(shù)變化Appendix S1 Cumulative death of newly transformed juvenile

致謝:

感謝安徽水韻軟體動(dòng)物繁育科技有限公司提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 感謝張歡在實(shí)驗(yàn)中提供的幫助, 感謝Kazi Belal Uddin 對(duì)本文英文部分修改潤(rùn)色提供的幫助。