咪唑類離子液體長(zhǎng)期暴露對(duì)鯉腸道形態(tài)、氧化應(yīng)激、免疫和腸道菌群的影響

張艷敏 馬麗美 蔡慧敏 梁曉敏 游 富 江愛霞 楊國(guó)坤 張新黨 申亞偉 常緒路 孟曉林

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心, 新鄉(xiāng) 453007)

咪唑類離子液體(Alkyl ionic liquids, AILs)種類繁多, 被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型溶劑, 廣泛應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)[1]、生物醫(yī)藥[2]等領(lǐng)域。最新研究表明,AILs對(duì)藻類[3]、大型溞[4]等水生生物存在一定的生態(tài)毒性, 且AILs對(duì)水生生物的毒性存在一定的“烷基鏈效應(yīng)”, 即毒性隨烷基鏈長(zhǎng)度的增加而逐漸增加[5]。Shao等[6]發(fā)現(xiàn)用不同碳鏈長(zhǎng)度的咪唑硝酸鹽離子液體[Cnmim]NO3脅迫蚯蚓(Eisenia fetida)時(shí),當(dāng)烷基鏈長(zhǎng)度從2增至8, 其對(duì)蚯蚓的急性毒性逐漸增加。然而, 目前, 此類研究大多集中于低等水生生物(如藻類、大型溞、鹵蟲等), 且多為急性暴露實(shí)驗(yàn)[7—9]。不同烷基鏈AILs對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)數(shù)量最為龐大的脊椎動(dòng)物——魚類長(zhǎng)期暴露的生態(tài)毒性(如是否存在烷基鏈效應(yīng))尚不明確[10—12]。

魚類腸道因具有廣闊的表面積和生理特性, 被認(rèn)為是消化、營(yíng)養(yǎng)獲取和毒素暴露的首要機(jī)械和免疫屏障[13,14]。同時(shí), 腸道微環(huán)境中棲息著功能多樣的微生物群落, 能夠分泌維生素、酶、免疫調(diào)節(jié)因子及形成非特異性的保護(hù)膜[15,17]。穩(wěn)定的腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理功能, 如病原體抗性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、能量代謝和免疫調(diào)節(jié), 促進(jìn)和維持宿主健康[18—20]。然而, 不同烷基鏈AILs對(duì)魚類腸道的生態(tài)毒性尚有待探究。

鯉(Cyprinus carpio.L)為水生生態(tài)系統(tǒng)常見魚類, 常作為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的模式動(dòng)物[21]。因此本研究選擇黃河鯉為受試對(duì)象, 探究3種不同烷基鏈AILs([C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl)長(zhǎng)期暴露對(duì)鯉腸道物理屏障、氧化應(yīng)激、免疫和腸道菌群的影響, 以期揭示不同烷基鏈AILs長(zhǎng)期暴露對(duì)魚類腸道的毒性作用, 從而為AILs對(duì)魚類的生態(tài)毒性機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃河鯉幼魚(3.0±0.5) g購(gòu)自河南省延津縣漁場(chǎng),魚體質(zhì)健康、遺傳背景一致。以商業(yè)飼料(通威,中國(guó))于河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周。

1.2 慢性暴露實(shí)驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)確定3種AILs([C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl)對(duì)鯉的72h-LC50值[22]。選用3種AILs對(duì)鯉72h-LC50值的1/100為長(zhǎng)期暴露濃度(分別為4.97、2.15和0.09 mg/L)。將馴化后的360尾魚平均分為4組, 每組3個(gè)重復(fù): 對(duì)照組(NC)和[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl處理組。采用鯉商品飼料(通威, 中國(guó))飽食投喂實(shí)驗(yàn)魚, 每日3 次(08:00、12:00和18:00), 實(shí)驗(yàn)持續(xù)30d, 每?jī)扇崭鼡Q50%暴露液, 水質(zhì)維持在溶解氧5—6 mg/L、氨氮＜0.01 mg/L、pH 7.1—7.4、水溫(26±1)℃。在實(shí)驗(yàn)終止后, 用MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚, 無(wú)菌環(huán)境下解剖,進(jìn)行樣品取材。

1.3 中腸組織形態(tài)學(xué)觀察

每桶隨機(jī)取6尾魚, 分離中腸組織。磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L PBS)沖洗后用4%多聚甲醛溶液固定, 梯度乙醇脫水, 用石蠟包埋切片機(jī)將蠟塊切成4 μm厚, 蘇木精和伊紅(HE)染色后, 在光學(xué)顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)各組腸道絨毛高度和肌層厚度[21]。

1.4 腸道酶活性測(cè)定

每組隨機(jī)取12尾魚, 分離中腸組織樣品, 液氮速凍, -80℃保存。腸道組織的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)、總抗氧化能力(T-AOC)、乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 腸道免疫基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

每組隨機(jī)取12尾魚, 分離中腸組織于1.5 mL無(wú)菌無(wú)酶離心管中, 液氮速凍后-80℃保存。樣品提取RNA后使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa, 大連)劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 18S rRNA基因作為內(nèi)參。熒光定量PCR反應(yīng)體系: 5 μL SYBR?Premix ExTaqTM(TaKaRa, 大連), 0.3 μL正向引物(10 μmol/L), 0.3 μL反向引物(10 μmol/L), 1.0 μL cDNA模板, 3.4 μL無(wú)菌水。擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃, 30s;95℃, 5s; 60℃, 0, 共40個(gè)循環(huán), 每樣品設(shè)3個(gè)平行(RocheLightCycler?480, 瑞士)。熒光定量PCR引物由上海生物工程股份有限公司合成, 引物序列見表1,基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time fluorescence quantification qPCR

1.6 腸道菌群測(cè)序分析

每組隨機(jī)選擇12尾魚, 無(wú)菌環(huán)境下取腸道內(nèi)容物, 將4尾魚腸道內(nèi)容物混合置于1個(gè)2 mL無(wú)菌離心管中, 液氮速凍, 放置-80℃保存。腸道菌群DNA樣品采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp,德國(guó))試劑盒依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行提取。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000全自動(dòng)超微量分光光度計(jì)(Thermo, 美國(guó)), 確定DNA樣品的質(zhì)量和濃度, 將檢測(cè)合格的樣品送往廣州基迪奧生物科技有限公司(廣州, 中國(guó))進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

相關(guān)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22軟件, 以O(shè)ne-way ANOVE及Duncan法進(jìn)行多重比較分析及顯著性檢驗(yàn), 若P＞0.05, 表示各組間差異無(wú)顯著性;若P＜0.05, 表示各組間差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AILs暴露對(duì)黃河鯉腸道組織形態(tài)的影響

3種不同烷基鏈咪唑類離子液體暴露處理30d后, 鯉腸道HE染色結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組的腸絨毛結(jié)構(gòu)相對(duì)正常, 無(wú)明顯損傷, 腸道組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞排列緊密, 呈規(guī)則柵欄狀排列, 固有層緊密。離子液體暴露組出現(xiàn)腸細(xì)胞脫落和空泡化現(xiàn)象, 腸道結(jié)構(gòu)不完整(圖1A)。隨著咪唑類離子液體烷基鏈長(zhǎng)度的增加, 腸道絨毛高度顯著降低, 肌層厚度顯著變薄(圖1B和1C;P＜0.05), 腸道組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。

圖1 不同AILs暴露對(duì)鯉腸道組織形態(tài)的影響Fig.1 Effects of different AILs on intestine histology of C.carpio L.

2.2 AILs暴露對(duì)黃河鯉腸道氧化應(yīng)激的影響

與NC組相比, [C12mim]Cl處理組鯉腸道組織GSH-Px、T-AOC和LDH活性或水平顯著性升高(P＜0.05; 圖2B—2D); [C8mim]Cl處理組腸道組織TAOC水平顯著性升高(P＜0.05; 圖2C); [C6mim]Cl處理組鯉腸道組織GSH-Px、CAT和LDH活性降低, 腸道組織T-AOC水平升高, 但均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

圖2 不同AILs對(duì)鯉腸道酶活性的影響Fig.2 Effect of different AILs on intestinal enzyme activity of C.carpio L.

2.3 AILs暴露對(duì)鯉腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖3所示, 與NC組相比, 促炎基因IL-6在[C12mim]Cl組的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),在[C6mim]Cl和[C8mim]Cl組的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著升高(圖3A); 促炎基因IL-8在[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組中mRNA表達(dá)量均顯著上升(P＜0.05; 圖3B), 抑炎基因TGF-βmRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.05; 圖3E)。

圖3 不同AILs對(duì)鯉腸道免疫相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of different AILs on mRNA relative expression level of immune related genes in the intestinal of C.carpio L.

2.4 AILs暴露對(duì)鯉腸道菌群的影響

由表2可知, 各組樣品Coverage覆蓋率均大于99.00%, 表明該測(cè)序結(jié)果能有效反映樣本的微生物群落多樣性。與NC組相比, [C6mim]Cl和[C12mim]Cl處理組Simpson指數(shù)顯著降低(P＜0.05), Chao1和Ace指數(shù)極顯著增加(P＜0.05)。[C6mim]Cl處理組Chao1和Ace等α多樣性指數(shù)最高。這表明在不同AILs暴露后, 鯉腸道微生物群落α多樣性呈增加趨勢(shì)。

表2 不同AILs暴露30d對(duì)黃河鯉腸道菌群多樣性及豐富度的影響Tab.2 Effects of 30d exposure to different AILs on intestinal microflora diversity and richness of C.carpio L.

采用主坐標(biāo)分析方法(Principal coordinate Analysis, PCoA)及非加權(quán)組平均法(Unweighted pairgroup method with arithmetic means, UPGMA)評(píng)估不同群落樣本之間的相似性。從PCoA圖中可以看出NC組與離子液體暴露組鯉腸道微生物組成距離相遠(yuǎn), [C8mim]Cl和[C12mim]Cl組間聚類明顯(圖4A)。UPGMA分析結(jié)果也顯示離子液體暴露組與NC組距離相差較遠(yuǎn)(圖4B)。這說(shuō)明3種咪唑類離子液體暴露改變了鯉腸道微生物的組成。

圖4 不同組間鯉腸道菌群PCoA分析和UPGMA分析Fig.4 PCoA analysis and UPGMA analysis of each group of C.carpio L.

在門水平上, 各組腸道菌群中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)為優(yōu)勢(shì)微生物類群(圖5A)。其中, 變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度最高(其在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為72.21%、71.65%、82.93%和77.18%), 其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)(其在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為4.23%、17.71%、12.20%和13.99%)和梭桿菌門(Fusobacteria; 其在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為18.03%、2.44%、2.59%和2.12%)。比較而言, AILs暴露組Proteobacteria相對(duì)豐度升高, Fusobacteria相對(duì)豐度顯著降低(P＜0.05;圖5B和5C)。Bacteroidetes的相對(duì)豐度在[C6mim]Cl處理組中顯著增加(P＜0.05; 圖5D),Firmicutes的相對(duì)豐度在[C8mim]Cl和[C12mim]Cl處理組中顯著下降(P＜0.05; 圖5E),Firmicutes和Bacteroidetes相對(duì)豐度的比值在AILs暴露組中顯著降低(P＜0.05; 圖5F)。此外, 各AILs暴露組螺旋體門(Spirochaetes)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)的相對(duì)豐度降低, [C6mim]Cl處理組放線菌門(Actinobacteria)相對(duì)豐度下降, 疣微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)豐度增加。

圖5 不同AILs暴露30d對(duì)黃河鯉腸道菌群門水平(Phylum)相對(duì)豐度的影響Fig.5 Effects of 30d exposure to different AILs on relative abundance of intestinal microflora (Phylum) of C.carpio L.

由圖6可知, 在屬水平上, 各組腸道菌群中氣單胞菌屬(Aeromonas)相對(duì)豐度最高(其在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為48.00%、44.19%、36.77%和25.17%)、其次是纖維弧菌屬(Cellvibrio; 在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為5.98%、4.04%、27.31%和27.16%)、黃桿菌屬(Flavobacterium; 在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl、[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為3.80%、17.39%、12.07%和13.71%)、假單胞菌屬(Pseudomonas; 在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl、[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為3.24%、9.08%、11.34%和12.83%)和鯨桿菌屬(Cetobacterium; 在NC、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組的相對(duì)豐度分別為18.03%、2.44%、2.59%和2.12%; 圖6A)。與NC相比, 各實(shí)驗(yàn)組Aeromonas相對(duì)豐度下降([C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組分別下降3.81%、11.23%和22.83%),Cetobacterium相對(duì)豐度顯著降低([C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl組分別下降15.59%、15.44%和15.91%;P＜0.05; 圖6B和6F)。[C6mim]Cl處理組Flavobacterium和Pseudomonas相對(duì)豐度顯著升高(P＜0.05), [C8mim]Cl和[C12mim]Cl處理組Cellvibrio和Pseudomonas相對(duì)豐度顯著升高(P＜0.05),此外, [C12mim]Cl處理組Pseudomonas的相對(duì)豐度也顯著升高(P＜0.05; 圖6C—E)。

圖6 不同AILs暴露30d對(duì)黃河鯉腸道菌群屬水平(Genus)相對(duì)豐度的影響Fig.6 Effects of 30d exposure to different AILs on the relative abundance of intestinal flora of C.carpio L.

基于16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果的PICRUSt2功能預(yù)測(cè)結(jié)果分析表明, 與NC組相比,[C6mim]Cl、[C12mim]Cl組腸道菌群中與輔助因子和維生素代謝、外源生物降解和代、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝及其他氨基酸的代謝等相關(guān)代謝途徑豐度升高; [C8mim]Cl組無(wú)顯著性變化(圖7)。

圖7 不同AILs暴露30d對(duì)黃河鯉腸道微生物PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析Fig.7 Effects of 30d exposure to different AILs on the prediction of PICRUSt2 function of intestinal flora of C.carpio L.

3 討論

3.1 不同烷基鏈AILs對(duì)鯉腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸道形態(tài)的完整性在維持正常的腸道屏障功能以及消化和吸收能力方面發(fā)揮著重要作用[23]。腸道結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化在一定程度上反映了魚類的腸道甚至機(jī)體的健康水平[21]。在本研究中, 不用烷基鏈AILs([C6mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl)暴露30d后對(duì)鯉腸上皮結(jié)構(gòu)均有明顯損傷, 隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加, 腸道絨毛高度顯著降低, 肌層厚度顯著下降, 腸道組織損傷更為嚴(yán)重(圖1), 表明腸道屏障通透性和易感性增加, 從而證實(shí)了不同烷基鏈AILs暴露可能對(duì)鯉腸道消化吸收能力和免疫功能產(chǎn)生影響, 且隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加, 腸道組織損傷更為嚴(yán)重[24]。

3.2 不同烷基鏈AILs對(duì)鯉腸道氧化應(yīng)激的影響

在魚類受到脅迫后, 體內(nèi)ROS含量會(huì)發(fā)生變化,當(dāng)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生速率快于氧自由基的清除速率時(shí), 生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)便會(huì)被激活[25,26]。其中, CAT和GSH-PX是關(guān)鍵的抗氧化酶, 且在機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激中具有重要作用。GSH-Px和CAT是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中的兩種抗氧化酶。T-AOC可用來(lái)衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能情況的綜合性指標(biāo)[27,28]。在污染的脅迫作用下, 抗氧化防御系統(tǒng)的主要特征是相關(guān)酶活性成分會(huì)發(fā)生變化, 因而可間接反映環(huán)境中污染的存在[29]。金魚[30]和蚯蚓[10]暴露于低濃度離子液體后, GSH-Px酶活性升高, CAT活性無(wú)顯著變化。這可能是在低濃度毒物的誘導(dǎo),使得GSH-Px活性升高來(lái)清除產(chǎn)生的自由基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, [C12mim]Cl處理組鯉腸道組織的GSHPx活性顯著升高。其原因是不同烷基鏈AILs的長(zhǎng)期暴露, 可能導(dǎo)致鯉體內(nèi)產(chǎn)生了較多的自由基, 為消除這些有害物質(zhì), 其抗氧化防御系統(tǒng)被激活,GSH-Px活性升高來(lái)清除產(chǎn)生的自由基, 使鯉免受氧化損傷。但CAT作為一種很高效的酶, 可以將H2O2分解成無(wú)毒的H2和O2, 當(dāng)?shù)孜颒2O2到達(dá)較高濃度時(shí)仍不會(huì)飽和, CAT活性沒有立刻改變[31,32]。在本研究中, [C8mim]Cl和[C12mim]Cl處理組鯉腸道組織的T-AOC水平升高, 表明AILs在一定程度可刺激鯉腸道組織的T-AOC水平上升, 提高機(jī)體的總抗氧化能力, 可能是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對(duì)AILs長(zhǎng)期暴露的代償性反應(yīng)導(dǎo)致的[31]。LDH活性的增加常常是細(xì)胞不可逆損傷或壞死的標(biāo)志, 是用來(lái)評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)[33]。章龍珍等[34]研究發(fā)現(xiàn), 隨著鉛(Pb)暴露劑量增加, 中華鱘幼魚血液中LDH活力上升, 魚體受到損傷。這與本研究結(jié)果相似, [C12mim]Cl處理組鯉腸道組織的LDH活性顯著升高。這可能是因?yàn)锳ILs長(zhǎng)期暴露后增強(qiáng)鯉的能量代謝能力, 機(jī)體組織器官可能出現(xiàn)損傷或病變。上述結(jié)果表明,AILs在一定程度上通過(guò)提高鯉腸道組織GSH-Px活性和T-AOC水平應(yīng)對(duì)其對(duì)機(jī)體造成的氧化脅迫或損傷。

3.3 不同烷基鏈AILs對(duì)鯉腸道免疫基因相關(guān)表達(dá)量的影響

動(dòng)物腸道嚴(yán)重?fù)p傷通常會(huì)導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)激活[18], IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和TGF-β是宿主的免疫細(xì)胞因子, 主要由T細(xì)胞、淋巴因子、巨噬細(xì)胞及其他抗原呈遞細(xì)胞等分泌,在調(diào)節(jié)動(dòng)物炎癥反應(yīng)和免疫功能中發(fā)揮重要作用,通常被認(rèn)為是預(yù)測(cè)炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物[35,36]。在本研究中, 與NC相比, 3種烷基鏈AILs暴露可以顯著升高促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8基因mRNA的表達(dá)水平, 且隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加, 基因的表達(dá)水平升高, 這與方美娟[37]將斑馬魚暴露于抗生素中的結(jié)果相一致, 促炎基因顯著上調(diào), 表明低濃度AILs暴露可能通過(guò)誘導(dǎo)魚體升高免疫基因的表達(dá)量來(lái)對(duì)環(huán)境脅迫。王馨等[38]研究表明, 在感染結(jié)核桿菌后小鼠血清中IL-12基因表達(dá)水平顯著降低, 本實(shí)驗(yàn)中3組暴露組的IL-12基因表達(dá)水平相較于NC組都有顯著的降低, 表明AILs長(zhǎng)期暴露會(huì)抑制促炎細(xì)胞因子IL-12基因的正常表達(dá), 導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂。促炎細(xì)胞因子TNF-α負(fù)責(zé)魚體內(nèi)炎癥過(guò)程的激活和擴(kuò)展, 抗炎細(xì)胞因子TGF-β負(fù)向調(diào)節(jié)魚類炎癥反應(yīng)激活。Chang等[13]發(fā)現(xiàn)([C8mim][PF6])暴露可以通過(guò)增加鯉腸道TNF-α水平, 降低TGF-β水平破壞魚類腸道免疫功能, 引發(fā)炎癥反應(yīng)。在本研究中,3組暴露組的促炎因子TNF-α基因表達(dá)被不同程度抑制, [C6mim]Cl實(shí)驗(yàn)組的TGF-β基因表達(dá)水平相較于NC無(wú)顯著差異, 其余兩組TGF-β基因的表達(dá)NC相比有顯著增加。綜上所述, 不同烷基鏈AILs會(huì)在一定程度上引發(fā)炎癥, 破壞鯉的腸道免疫功能,[C6mim]Cl對(duì)腸道免疫功能的傷害較小, 而隨著烷基鏈增加([C8mim]Cl和[C12mim]Cl組), AILs對(duì)腸道免疫功能的損傷也隨之增加。

3.4 不同烷基鏈AILs對(duì)鯉腸道菌群的影響

環(huán)境因素可導(dǎo)致魚類腸道微生物組成發(fā)生巨大變化[39], 但不同烷基鏈AILs對(duì)腸道菌群變化的影響尚不清楚。腸道菌群通過(guò)調(diào)節(jié)多種生理功能影響宿主健康, 包括病原體抗性和免疫調(diào)節(jié)[40,41]。結(jié)果表明, 在不同烷基鏈AILs長(zhǎng)期暴露后, 鯉腸道微生物群多樣性和豐富度增加, 且[C6mim]Cl對(duì)鯉腸道菌群多樣性的影響最明顯。此前, 也有研究證實(shí)采用納米銀和環(huán)境劑量鎘對(duì)斑馬魚進(jìn)行暴露處理,能提高腸道微生物群落多樣性和豐富度[23,27], 表明低濃度環(huán)境污染物毒性干擾可能減少有益菌的數(shù)目, 誘導(dǎo)鯉腸道菌群失調(diào), 使外來(lái)病原菌能夠突破其腸道及共生菌群防線在腸道內(nèi)定植使菌群多樣性上升。

此外, 本研究發(fā)現(xiàn), 不同烷基鏈AILs長(zhǎng)期暴露后, Fusobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes仍為鯉腸道中的優(yōu)勢(shì)門[42], AILs暴露組Proteobacteria相對(duì)豐度升高, Fusobacteria相對(duì)豐度顯著降低,Bacteroidetes的相對(duì)豐度在[C6mim]Cl處理組中顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn), Fusobacteria和Firmicutes都是丁酸產(chǎn)生菌, 而丁酸能夠增強(qiáng)鯉生長(zhǎng)性能、腸道屏障功能及抗炎能力[43]。這表明, 不同烷基鏈AILs的長(zhǎng)期暴露可以通過(guò)抑制這些丁酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)來(lái)降低鯉的免疫能力。Firmicutes與Bacteroidetes的比值被廣泛認(rèn)為對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)的正常有重要作用, 降低與炎癥性腸病有關(guān)[39,44]。在本研究中,各處理組Firmicutes與Bacteroidetes的比值極顯著降低。這表明不同烷基鏈AILs暴露可能改變了鯉腸道菌群的穩(wěn)態(tài)和群落組成, 導(dǎo)致腸道產(chǎn)生炎癥。有研究表明, Proteobacteria含有病原體, 其豐度增加可能破壞腸道穩(wěn)態(tài), 增加腸道通透性, 進(jìn)而引發(fā)腸炎性疾病[45], 提示不同烷基鏈AILs可能通過(guò)增加Proteobacteria的相對(duì)豐度來(lái)破壞鯉腸道穩(wěn)態(tài), 進(jìn)而影響其免疫能力。Verrucomicrobia門被認(rèn)為是污染水體底泥中的優(yōu)勢(shì)類群, 能分解有機(jī)污染物, 不同烷基鏈AILs暴露導(dǎo)致Verrucomicrobia相對(duì)豐度增加, 表明不同烷基鏈AILs暴露可能可以增加鯉腸道降解污染物菌群的豐度, 是腸道黏膜層對(duì)環(huán)境脅迫的一種響應(yīng)[46]。

Aeromonas廣泛分布在水生環(huán)境中,Aeromonas參與纖維素的分解, 健康魚類腸道中Aeromonas的高豐度與宿主的消化功能密切相關(guān)[47]。有研究發(fā)現(xiàn),Cetobacterium主要參與氨基酸和糖類的代謝,產(chǎn)生維生素B12, 更重要的是, 其菌體多糖能顯著提高斑馬魚的抗病毒能力[48,49]。在本研究中,Aeromonas和Cetobacterium相對(duì)豐度的下降表明不同烷基鏈AILs暴露可能通過(guò)抑制Aeromonas和Cetobacterium的生長(zhǎng), 從而降低鯉的消化和抗感染能力, 導(dǎo)致腸道內(nèi)致病菌增加。Shewanella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio已被證明與魚類的細(xì)菌性疾病有關(guān)[50,51]。各實(shí)驗(yàn)組Shewanella相對(duì)豐度升高,此外, [C6mim]Cl處理組Luteolibacter、Flavobacterium和Pseudomonas相對(duì)豐度顯著升高, [C8mim]Cl處理組Cellvibrio和Pseudomonas相對(duì)豐度顯著升高, [C12mim]Cl處理組Cellvibrio和Pseudomonas相對(duì)豐度顯著升高。綜上所述, 不同烷基鏈AILs暴露改變鯉腸道菌群結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致Shewanella、Flavobacterium、Pseudomonas和Cellvibrio等致病菌豐度顯著增加,Cetobacterium和Aeromonas等潛在有益菌豐度降低, 且毒性隨烷基鏈增加呈一定上升趨勢(shì)。

腸道菌群的功能和宿主的生理反應(yīng)取決于腸道中微生物的組成和功能[52]。本研究基于16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果的PICRUSt2進(jìn)行代謝功能分析表明, [C6mim]Cl和[C12mim]Cl提升了與輔助因子和維生素代謝、外源生物降解和代、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和其他氨基酸的代謝等相關(guān)代謝途徑豐度, [C8mim]Cl無(wú)明顯變化。有研究發(fā)現(xiàn), 外源物質(zhì)生物降解及代謝功能相對(duì)豐度升高, 即對(duì)這些有毒有害物質(zhì)的降解代謝能力升高[53], 氨基酸代謝可以幫助細(xì)菌吸收氨基酸, 有利于加速有機(jī)物礦化, 促進(jìn)氨素吸收利用[54], 碳水化合物代謝與碳循環(huán)密切相關(guān)[55]。因此, [C6mim]Cl和[C12mim]Cl的環(huán)境脅迫使鯉腸道菌群對(duì)于有毒有害物質(zhì)的降解代謝能力增強(qiáng), 可能是不同烷基鏈AILs作為外來(lái)碳源改變了腸道微生態(tài)環(huán)境, 促使細(xì)菌碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝及其他氨基酸的代謝功能相對(duì)豐度升高,進(jìn)而使腸道菌群中碳氨循環(huán)效率得以提升。此外,有研究發(fā)現(xiàn), AILs對(duì)水生生物的毒性存在一定的“截?cái)嘈?yīng)”, 即當(dāng)離子液體長(zhǎng)度從2增加到8時(shí), 離子液體對(duì)水生生物的毒性逐漸增加, 當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度增加到10時(shí), 離子液體的毒性逐漸減小[6]。與本研究結(jié)果相似, 即低毒性的[C6mim]Cl和[C12mim]Cl暴露使鯉腸道微生物碳水化合物等代謝功能富集, 但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述, 不同烷基鏈AILs暴露均可造成鯉腸道形態(tài)、氧化應(yīng)激和免疫損傷, 腸道有益菌門(Fusobacteria、Actinobacteria和Firmicutes等)和有益菌屬(Cetobacterium和Aeromonas等)的相對(duì)豐度逐漸降低, 致病菌門(Proteobacteria和Bacteroidetes等)和致病菌屬(Shewanella、Flavobacterium、Pseudomonas、Cellvibrio等)的相對(duì)豐度逐漸升高, 腸道菌群結(jié)構(gòu)改變, 其毒性隨烷基鏈增加呈一定上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果將為不同烷基鏈AILs對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)魚類腸道的生態(tài)毒性機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。