苯扎貝特通過(guò)AKT/mTOR 通路抑制肺腺癌糖酵解機(jī)制研究

李智斌，葉錦霞，巫艷，王桂平

（廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510450）

肺癌是我國(guó)以及全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康和生命[1-2]，其中肺腺癌是主要肺癌病理類型，發(fā)病率約占肺癌的30%～50%。目前，臨床普遍采用外科治療、放射治療和化學(xué)治療等多學(xué)科綜合治療方法對(duì)肺癌進(jìn)行治療，而對(duì)于腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移不能進(jìn)行手術(shù)切除的患者，化學(xué)治療仍是最主要的治療手段。當(dāng)前，肺腺癌的治療藥物主要涉及鉑類、第三代細(xì)胞毒藥物（吉西他濱、紫杉醇、培美曲塞等）、EGFR-TK抑制劑、EGFR 單抗等[3]。然而，絕大多數(shù)肺癌患者的預(yù)后仍然十分不理想，總體5年生存率僅為10%～15%左右。

苯扎貝特（bezafibrate）是臨床常用的一種貝特類降脂藥。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特可有效抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苯扎貝特可有效抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，荷人肺腺癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示苯扎貝特可抑制移植瘤生長(zhǎng)[4-5]。前期工作還證實(shí)了苯扎貝特或聯(lián)合順鉑可有效抑制HIF-1α的表達(dá)，從而抑制肺腺癌的生長(zhǎng)[6]。而前期生物信息預(yù)測(cè)揭示，該藥可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，發(fā)揮抗肺腺癌作用。HIF-1α是PI3K/AKT/mTOR 下游重要因子，mTOR 活化后可上調(diào)HIF-1α表達(dá)，從而調(diào)控糖酵解過(guò)程。苯扎貝特可能是通過(guò)激動(dòng)PPARα 受體通路，抑制PI3K/AKT/mTOR 途徑功能，逆轉(zhuǎn)肺腺癌瓦博格效應(yīng)（Warburg effect），糾正腫瘤組織異常的物質(zhì)代謝，發(fā)揮抗肺腺癌作用。目前關(guān)于苯扎貝特的抗腫瘤機(jī)制尚不清楚，本文通過(guò)細(xì)胞功能、代謝、蛋白水平，利用細(xì)胞活性檢測(cè)、WB 等技術(shù)觀察苯扎貝特對(duì)肺腺癌細(xì)胞的作用，探討該藥治療肺腺癌的分子機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與辦法

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，解凍復(fù)蘇、重懸后接種在RPMI Medium1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素）中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

TD5K-Ⅱ臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BDS400 倒置生物顯微鏡（奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；3111 型CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；液氮生物容器（四川亞西機(jī)器有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀[賽默飛世界爾（上海）儀器有限公司]；BG-Power 600i 電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；JY92-IIN 超聲儀細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

苯扎貝特（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、二甲基亞砜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；RPMI Medium1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；葡萄糖（GLU）試劑盒、乳酸（LD）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；磷酸酶抑制劑、BCA 法蛋白含量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）；RIPA 裂解液、一抗稀釋液（碧云天生物）；AKT、mTOR 和PKM2 一抗（美國(guó)Proteintech Group）；GAPDH二抗（美國(guó)Proteintech Group）。

1.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104/mL，以100 μL/孔接種到96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)苯扎貝特組（25、50、100、200、400μmol/L）、陰性對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)基）、空白對(duì)照組（不加入細(xì)胞），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于加藥48 h 和72 h 后，取出培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8 溶液各10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值（A）。

1.4 葡萄糖含量測(cè)定試驗(yàn)

按“1.3”細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞分組，取經(jīng)藥物作用72 h后的細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min后，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，用等滲緩沖液清洗，1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀；加入適量勻漿介質(zhì)進(jìn)行勻漿，冰水浴條件下超聲粉碎，按試劑盒操作順序加入相應(yīng)試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于波長(zhǎng)340 nm 處的吸光度值；按試劑盒計(jì)算公式計(jì)算得到各樣品對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量[7]。

1.5 乳酸含量測(cè)定試驗(yàn)

按“1.3”細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞分組，取經(jīng)藥物作用24 h 后的細(xì)胞液，稀釋后，按乳酸測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)配制酶工作液，并準(zhǔn)備空白管（蒸餾水20μL+ 酶工作液1 mL + 顯色劑200 μL）、標(biāo)準(zhǔn)管（3 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品20μL+酶工作液1 mL+顯色劑200μL）和測(cè)定管（待測(cè)樣品20μL+酶工作液1 mL+顯色劑200 μL），混勻，37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min 后，每管加入終止液2 mL。在酶標(biāo)儀530 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度值，用空白管調(diào)零，測(cè)定各管的吸光度值。按試劑盒計(jì)算公式計(jì)算各管乳酸含量。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104/mL，以100 μL/孔接種到96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入苯扎貝特試液（100、200、400 μmol/L），對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。以PBS 洗滌2 次，每孔加入100 μL含1% PMSF（100 mmol/L）和1% Cocktail 的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min；裂解完后于4 ℃下14 000 r/min 離心5 min，收集上清液；采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，于95 ℃煮沸10 min 進(jìn)行蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。加入5% 脫脂奶粉溶液于室溫封閉2 h，TBST洗膜8 min，1次；分別加入AKT、mTOR和PKM2 抗體于4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次，加入Rabbit Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP（1∶10 000），于室溫孵育50 min～3 h；TBST 洗滌3 次，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯影曝光。采用Image J 軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 苯扎貝特對(duì)肺癌A549細(xì)胞的體外抑制作用

結(jié)果見(jiàn)表1。苯扎貝特對(duì)肺癌A549 細(xì)胞有明顯抑制作用，在相同時(shí)間組內(nèi)，隨著苯扎貝特用藥濃度的升高，細(xì)胞抑制率也逐步增加，由此可得，苯扎貝特對(duì)A549 細(xì)胞的抑制作用隨濃度增大而增大，48 h 的IC50值為453.30 μmol/L，72 h 的IC50值為439.67 μmol/L；而在相同用藥劑量組內(nèi)，72 h 給藥組較48 h 給藥組細(xì)胞抑制率稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 苯扎貝特干預(yù)后A549細(xì)胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

表1 苯扎貝特干預(yù)后A549細(xì)胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

與0μmol/L比較：**P＜0.01。

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2.2 苯扎貝特對(duì)肺癌A549 細(xì)胞有氧糖酵解水平的影響

由表2結(jié)果可知，隨著苯扎貝特濃度增大，細(xì)胞中葡萄糖含量不斷增加，乳酸含量不斷降低。由于各孔為平衡孔，即細(xì)胞初始數(shù)量、葡萄糖初始含量及乳酸初始含量一致，該結(jié)果表明，在用藥過(guò)程中，隨著苯扎貝特濃度升高，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的消耗量不斷減少，乳酸產(chǎn)量不斷降低。

表2 苯扎貝特干預(yù)后A549細(xì)胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L?1)

表2 苯扎貝特干預(yù)后A549細(xì)胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L?1)

與0μmol/L比較：**P＜0.01。

?

2.3 苯扎貝特對(duì)肺癌A549細(xì)胞蛋白表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖1 及表3 所示。結(jié)果表明，苯扎貝特干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 后，隨著藥物濃度的升高，AKT、mTOR和PKM2的表達(dá)均有不同程度的降低，其中mTOR 蛋白下降較為明顯，且均呈現(xiàn)濃度依賴性。

表3 苯扎貝特干預(yù)后A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量Table 3 Expression of related proteins in A549 cells after bezafibrate intervention

3 討論

項(xiàng)目組前期基于基因表達(dá)譜藥物發(fā)現(xiàn)途徑，篩選到多種肺腺癌候選治療藥物，并通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)一種PPARα 受體激動(dòng)劑——苯扎貝特具有較好的抗肺腺癌作用[8]。本文細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，證明了苯扎貝特可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖。

正常細(xì)胞在常氧條件下，主要是通過(guò)氧化磷酸化的方式產(chǎn)生ATP，提供自身所需的能量，而在腫瘤細(xì)胞中，即使是常氧條件下，腫瘤細(xì)胞仍然優(yōu)先利用糖酵解途徑提供能量，其典型特點(diǎn)就是葡萄糖的攝取增加以及乳酸生成增加，這就是著名的瓦博格效應(yīng)[9]。苯扎貝特抗腫瘤作用的確切機(jī)制仍不清楚，而代謝異常是腫瘤發(fā)生的重要原因，逆轉(zhuǎn)“瓦博格效應(yīng)”的藥物開(kāi)發(fā)是當(dāng)前腫瘤研究的焦點(diǎn)[10-11]。本研究考察了使用不同濃度的苯扎貝特對(duì)A549 細(xì)胞糖酵解的影響，結(jié)果顯示，苯扎貝特對(duì)A549 細(xì)胞的葡萄糖攝取及乳酸生成有明顯的抑制作用，且抑制作用隨給藥濃度升高而增強(qiáng)，苯扎貝特具有一定的抑制A549 細(xì)胞有氧糖酵解的效應(yīng)，提示肺腺癌A549 細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與苯扎貝特下調(diào)糖酵解途徑，逆轉(zhuǎn)瓦博格效應(yīng)有關(guān)。

多篇文獻(xiàn)報(bào)道AKT/mTOR 信號(hào)通路[12]及丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）[13]與腫瘤細(xì)胞的糖酵解進(jìn)程有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特處理A549 細(xì)胞會(huì)降低AKT、mTOR 和PKM2 的蛋白表達(dá)。由此，本研究推測(cè)苯扎貝特可能通過(guò)調(diào)控AKT/mTOR 信號(hào)通路及PKM2，抑制A549 的糖酵解途徑，逆轉(zhuǎn)瓦博格效應(yīng)，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用，但其對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抑制機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。