急慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的建立與比較研究

劉闖，李依林，左澤平，田穎穎，趙新月，呂英楠，徐意，張碩峰，王志斌，

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102401；2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100071）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）的亞型之一，是一種以結(jié)腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)橹饕卣鞯穆苑翘禺愋匝装Y性疾病[1]，在臨床上具有難治愈、病程長、易復發(fā)等特點。流行病學數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)UC 的發(fā)病率呈上升趨勢，UC 的發(fā)病率和患病率在發(fā)達國家較高并趨于穩(wěn)定，在發(fā)展中國家較低但呈明顯上升趨勢。近年來，我國UC 門診就診人數(shù)呈增長趨勢[2]。為了探究UC 的發(fā)病機制并尋找能夠有效防止UC 的藥物，選擇理想的UC動物模型尤為重要。

目前常用的UC 臨床前研究動物模型主要包括化學誘導模型、免疫誘導模型、基因編輯模型以及中醫(yī)證候模型。其中化學誘導模型主要是通過化學試劑刺激誘導結(jié)腸黏膜損傷，進而發(fā)生UC[3]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）與噁唑酮（oxazolone，OXZ）是常見的2 種化學誘導劑，DSS 多通過自由飲水的方式進行模型制備，OXZ 多通過致敏后聯(lián)合乙醇灌腸的方式誘導UC[4]。本研究通過DSS 誘導小鼠慢性UC 和OXZ 誘導小鼠急性UC兩種模型并進行比較，以期能夠為UC治療方法及機制的研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57/6N 小鼠24 只，8 周齡，體質(zhì)量22～24 g；SPF 級雄性Balb/c 小鼠30 只，8 周齡，體質(zhì)量22～24 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0006，動物在室溫（23±2）℃、濕度40%～70%、12 h 晝夜交替環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司倫理審查委員會批準（批準號：YJY-2022-082902，YJY-2022-110301）。

1.2 主要試劑

DSS（MP Biomedicals，0216011080）；4-乙氧基亞甲基-2-苯基-2-惡唑啉-5-酮（噁唑酮，Sigmaaldrich，E0753-10G）；無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20211214）；TNF-α檢測試劑盒（SEA133Mu）、INF-γ檢測試劑盒（SEA049Mu）與IL-10 檢測試劑盒（SEA056Mu）均購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

BT 25 S 型萬分之一天平（賽多利斯）；ME3002精密天平（梅特勒-托利多）；BX53光學顯微鏡（日本Olympus）；VS200掃描儀（日本Olympus）。

2 方法

2.1 DSS誘導小鼠慢性UC模型[5]

C57/6N 小鼠適應性飼養(yǎng)后開始造模，分為對照組、模型組。模型組第1周1%DSS自由飲水，第2周到第3 周恢復小鼠正常飲水，第4 周更換為1%DSS自由飲水，第5 周到第6 周恢復正常飲水，第7 周更換為1%DSS 自由飲水。對照組始終給予正常動物飲水。期間每兩天進行1 次稱重與疾病活動指數(shù)（DAI）評分（見表1）。第7周結(jié)束后，剖檢取材。

表1 DAI評分標準Table 1 DAI scoring criteria

2.2 OXZ誘導小鼠急性UC模型[6]

Balb/c 小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分成對照組、模型組。模型組小鼠腹部剃毛，皮膚涂抹2.4%的OXZ（溶于無水乙醇）致敏劑0.2 mL，1 d 后重復涂抹1 次，實驗第5 天禁食不禁水24 h，第6 天將直徑2.5 mm的硅膠軟管插入結(jié)腸距肛緣約4 cm，緩緩注入0.8%的OXZ（溶于40%乙醇）造模劑0.1 mL，誘導制備UC 小鼠模型。對照組灌腸等量的生理鹽水。灌腸后每天進行DAI 評分，評分標準見表1。灌腸后1周進行剖檢。

2.3 剖檢與取材

剖檢前一天禁食不禁水，異氟烷對小鼠進行吸入麻醉后，腹主靜脈取血，置于EDTA 抗凝管中，完成血液學檢測后，離心分離上清于?80 ℃保存。取小鼠結(jié)腸（盲腸至恥骨聯(lián)合處）、心臟、肝臟、脾臟、胸腺、腎臟、全腦，測量或稱重后使用4%（φ）多聚甲醛進行固定，或置于液氮中進行凍存。剖檢過程中對結(jié)腸進行拍照記錄測量結(jié)腸長度，取材后立即對各臟器進行稱重記錄，計算臟腦系數(shù)[7]（以臟腦比記），公式如下：

2.4 ELISA檢測小鼠結(jié)腸勻漿中相關(guān)細胞因子

樣本前處理：準確稱取小鼠結(jié)腸組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1 g∶18 mL 的比例加入PBS，放入研磨珠，制備結(jié)腸組織勻漿，4 ℃，3 500 r/min離心20 min，分裝上清液于EP 管中。根據(jù)BCA、IL-10、TNF-α、IL-1β試劑盒說明書對結(jié)腸勻漿中相關(guān)細胞因子進行檢測。

2.5 結(jié)腸組織病理檢查

所有結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛充分固定后，經(jīng)取材修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，HE 染色后光鏡檢查結(jié)腸橫截面組織病理學變化，記錄各組結(jié)腸橫截面。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察

3.1.1 DSS 誘導小鼠慢性UC 模型 DSS 造模小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、稀便與便血的癥狀，癥狀出現(xiàn)一般在DSS 自由飲水的第3 天以后出現(xiàn)。圖1A、B 所示為DSS 造模小鼠體質(zhì)量與DAI評分變化。在第1次開始給予DSS 自由飲水后第10 天，模型組小鼠DAI 評分與對照組比較開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）。反復誘導期間，DSS 自由飲水后小鼠癥狀加重，更換為普通飲水，小鼠癥狀開始緩解。

圖1 兩種模型小鼠體質(zhì)量與DAI評分變化Figure 1 Changes of body weight and DAI score in two model mice(,n=12)

3.1.2 OXZ 誘導小鼠急性UC 模型 第2 次腹部涂抹OXZ 致敏后，小鼠出現(xiàn)明顯過敏反應，表現(xiàn)為體質(zhì)量持續(xù)下降，毛色黯淡，耳廓表現(xiàn)出明顯紅腫。圖1C、D 所示為OXZ 造模中小鼠體質(zhì)量與DAI 評分變化。致敏后小鼠體質(zhì)量即開始下降，而DAI 評分無顯著變化。灌腸后，小鼠反應明顯，當天即出現(xiàn)黏液便與便血的癥狀，DAI 評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），灌腸后第3 天小鼠癥狀最為嚴重，期間出現(xiàn)造模小鼠死亡的情況，第4天以后造模小鼠癥狀逐漸開始恢復，但與對照組比較仍有顯著差異（P＜0.05）。

3.2 結(jié)腸大體觀察與臟器指數(shù)

剖檢過程中發(fā)現(xiàn)，DSS 誘導UC 小鼠結(jié)腸顯著縮短（P＜0.01），且可見明顯出血（圖2），模型組小鼠胸腺指數(shù)與腎臟指數(shù)與對照組比較出現(xiàn)顯著降低（P＜0.01），而脾臟指數(shù)出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.01）。OXZ誘導小鼠急性UC模型中正常組小鼠結(jié)腸表面光滑，無充血水腫等表現(xiàn)，結(jié)腸內(nèi)有成形的糞便。OXZ 模型組病變以遠端結(jié)腸為主，腸黏膜充血、水腫、潰瘍，并連續(xù)存在。對結(jié)腸長度進行統(tǒng)計分析，模型組結(jié)腸長度與對照組比較顯著縮短（P＜0.01）。

圖2 兩種UC模型小鼠結(jié)腸大體觀察Figure 2 Gross observation of the colon in two UC model mice(,n=12)

免疫因素在UC 的發(fā)病中有重要的作用，脾臟與胸腺是重要的免疫器官。兩種模型中，模型小鼠的脾臟指數(shù)與對照組相比均顯著升高（P＜0.01），而胸腺指數(shù)與對照組比較均顯著降低（P＜0.01），表明DSS與OXZ對小鼠的免疫系統(tǒng)有一定的抑制作用。除此之外，與OXZ誘導小鼠急性UC 模型不同，DSS誘導小鼠慢性UC 小鼠的腎臟指數(shù)出現(xiàn)了顯著降低（P＜0.01），該現(xiàn)象可能是DSS 誘導小鼠慢性UC 的結(jié)腸外癥狀。見圖3。

圖3 兩種UC模型小鼠臟器指數(shù)Figure 3 Organ indices in two UC model mice(,n=12)

3.3 血液學檢查

在DSS 誘導小鼠慢性UC 模型中，與對照組比較，模型組白細胞計數(shù)（WBC）顯著升高（P＜0.01），說明機體發(fā)生炎癥反應。模型組小鼠血液中的血小板計數(shù)（PLT）與血小板壓積（PCT）與對照組比較顯著升高（P＜0.01）。血液學檢查結(jié)果顯示，與對照組比較模型組小鼠血液中網(wǎng)織紅細胞百分比（%RETIC）顯著升高（P＜0.01），中性粒細胞/淋巴細胞（NLR）、血小板計數(shù)/淋巴細胞（PLR）顯著升高（P＜0.01）。見圖4。

圖4 血液學檢查結(jié)果Figure 4 Hematologic test results(,n=12)

在OXZ 誘導小鼠急性UC 模型中，模型組小鼠白細胞計數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，而模型組小鼠血液中的PLT、PCT 和%RETIC 與對照組相比顯著升高（P＜0.01）。模型組小鼠外周血NLR與PLR與對照組比較顯著升高（P＜0.05）。

3.4 ELISA檢測相關(guān)細胞因子

ELISA 檢測結(jié)果如圖5 所示，DSS 誘導慢性UC小鼠結(jié)腸組織勻漿中TNF-α水平和IL-10 水平與對照組比較均顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.01）。在OXZ 誘導小鼠急性UC 模型中，小鼠結(jié)腸組織勻漿中TNF-α水平和IL-10 水平與對照組比較均顯著升高（P＜0.05），而IFN-γ水平出現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖5 ELISA法檢測相關(guān)細胞因子結(jié)果Figure 5 Results of ELISA assay for relevant cytokines(,n=12)

3.5 病理檢查

如圖6所示，在兩種模型中，對照組小鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜各層形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整，細胞排列規(guī)則，腸道結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層無水腫增厚，腸基部無淋巴細胞聚集和炎性細胞浸潤，腸隱窩排列整齊。模型組結(jié)腸組織病理表現(xiàn)有所不同，如圖6A 所示，DSS 誘導的慢性UC 小鼠結(jié)腸局部黏膜上皮脫落，上皮損傷，大量炎癥細胞浸潤至黏膜下層，腸腺明顯擴張擴大，腸隱窩數(shù)量明顯減少，腸黏膜下層水腫增厚，隱窩扭曲并萎縮。OXZ 誘導急性UC小鼠結(jié)腸上皮細胞消失和（或）上皮組織再生，杯狀細胞減少或消失，結(jié)腸黏膜增厚，黏膜不完整，細胞排列不規(guī)則，有大量紅細胞及炎性細胞浸潤，腸壁水腫，纖維化，且上述病理表現(xiàn)在灌腸后第2天即出現(xiàn)，第3或第4天最為嚴重，灌腸后第7天有所緩解，潰瘍面積減少且可見隱窩再生（見圖6B）。

圖6 結(jié)腸組織病理HE染色Figure 6 HE staining of colon histopathology

4 討論

DSS 常用于UC 發(fā)病機制研究及并發(fā)癥研究，OXZ常用于UC急性發(fā)作期藥物藥效研究[5?6]。DSS是一種具有抗凝血特性的化合物，能夠誘導結(jié)腸上皮損傷。通過調(diào)整DSS 的濃度以及給藥頻次可以實現(xiàn)誘導結(jié)腸急性、慢性以及復發(fā)的模型，具有操作簡單、成功率高以及可重復的特點。研究認為DSS 對基底隱窩腸上皮細胞具有毒性，當上皮損傷時，屏障完整性受損，隨后黏膜和黏膜下免疫細胞暴露于腔內(nèi)抗原（例如細菌抗原），導致快速出現(xiàn)明顯的炎癥免疫反應。因此該模型常被用于研究腸道菌群和飲食等因素對結(jié)腸炎發(fā)病的影響以及固有免疫機制在黏膜炎癥發(fā)展和屏障完整性重建中的作用。DSS 是一種高分子化合物，無法穿過細胞膜且吸收不良，其作用僅限于結(jié)腸，而其他臟器所產(chǎn)生的損傷多由疾病本身造成，因此可用于研究UC疾病本身對其他臟器造成的傷害[8]。

噁唑酮是一種半抗原試劑，在小鼠直腸給藥后可引起嚴重的結(jié)腸炎。在OXZ 誘導的UC 模型中，固有層T 細胞產(chǎn)生的2 型和9 型細胞因子（IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13）的升高與人類觀察到的UC 的特征相似。分泌IL-13 的自然殺傷T 細胞被認為是疾病的重要觸發(fā)者，可能是通過CD1d 的抗原呈遞而激活。因此，該模型被用于研究腸道炎癥過程中與2型和9 型相關(guān)的免疫反應。同時，較低劑量的OXZ也可能誘導混合Th1/Th2應答[9]。

DSS 誘導小鼠UC 癥狀與臨床UC 患者癥狀一致。本研究過程中發(fā)現(xiàn)DSS 誘導慢性UC 的小鼠自由飲水5～7 d 成模，在自由飲水期間體質(zhì)量持續(xù)下降，出現(xiàn)稀便伴有明顯便血，血液學檢查發(fā)現(xiàn)小鼠白細胞、血小板及免疫炎癥指數(shù)升高，病理檢查發(fā)現(xiàn)黏膜下層水腫增厚明顯，造模死亡率0%；OXZ 誘導急性UC 的小鼠灌腸當天即出現(xiàn)癥狀，致敏期間體質(zhì)量下降，灌腸后前3 天體質(zhì)量下降，后逐漸恢復，黏液便明顯，造模初期可見便血，血液學檢查發(fā)現(xiàn)小鼠白細胞變化不明顯，病理檢查發(fā)現(xiàn)腸壁變薄，造模第3 天病理損傷最為嚴重，造模死亡率約50%，而存活下來的部分動物可能由于造模程度較輕且恢復較快而在試驗周期內(nèi)就恢復，無法與藥物治療組進行比較。在本研究中，出現(xiàn)OXZ 灌腸后，動物體質(zhì)量快速降低，部分動物由于機體損傷嚴重而死亡，出現(xiàn)動物死亡率較高的情況，而存活下來的部分動物可能由于造模程度較輕且恢復較快而在試驗周期內(nèi)就恢復，無法與藥物治療組進行比較。因此使用該模型進行藥理研究需要大量實驗小鼠，代價較高且可能會引發(fā)倫理問題。兩個模型小鼠均有脾臟指數(shù)上升，胸腺指數(shù)下降。

此外，在本研究預實驗中還利用Wistar 大鼠進行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠OXZ 造模雖然也出現(xiàn)了體質(zhì)量下降及稀便的癥狀，但幾乎未出現(xiàn)便血的情況，從造模結(jié)果無法診斷其為UC，且動物恢復速度較快，所有造模動物均在1周內(nèi)恢復正常狀態(tài)，不再有任何臨床癥狀。因此，作者考慮可能通過少量多次給予OXZ 灌腸反復誘導小鼠UC，降低模型動物死亡率并維持模型動物臨床癥狀，使該模型能更加適用于藥物治療UC 的藥理學研究。在對UC 的機制研究和其治療藥物的臨床前研究中應根據(jù)研究目的與實驗特點選擇合適的動物模型。