丙酸氯倍他索脂肪酸囊泡的經(jīng)皮滲透性及抗銀屑病藥效的初步研究

趙雅欣，李彥杰，付琳，鄒博航，張向宇

（佳木斯大學藥學院/佳木斯大學實驗動物中心，黑龍江 佳木斯 154007）

銀屑病是一種常見的慢性炎性皮膚病，以紅斑、鱗屑、浸潤為主要特征，病因復(fù)雜且預(yù)后不良，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1?5]。銀屑病的治療主要包括局部治療、光療和口服治療。局部治療是約80%的輕中度銀屑病患者的主要治療方法[6?10]。大多數(shù)皮膚病的誘因都是在皮膚下發(fā)現(xiàn)的，局部提供的藥物治療比全身的方法更受青睞，具有給藥方便、使用安全以及可避免首過效應(yīng)等優(yōu)點[11?12]。

丙酸氯倍他索（clobetasol propionate，CP）作為一種高效的糖皮質(zhì)激素[13]，具有抗炎、抗血管收縮、抗有絲分裂和免疫調(diào)節(jié)能力[14]。然而，CP 短期療效較好，長期局部應(yīng)用可誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)，如局部萎縮和色素沉著等[15]。丙酸氯倍他索常見劑型以軟膏、凝膠等普通劑型為主，普通劑型一般都存在滲透性差、吸收效果差、療效不理想等缺點。

脂肪酸囊泡（fatty acid vesicles，F(xiàn)AV）是由脂肪酸的鹽溶液自組裝形成的2層封閉脂質(zhì)膠體分散體系[16?18]，具有兩親性結(jié)構(gòu)，用于經(jīng)皮給藥具有良好的相容性和滲透性，并且脂肪酸具有高可溶性，很容易迅速地分解成人工膜和天然膜[19]。油酸是一種單不飽和ω-9 脂肪酸，參與炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[20]，并且皮膚中含有的各種脂肪酸油酸占比最高，因此制備含油酸的脂肪酸囊泡更有利于膜的融合[21]，有助于增強皮膚的屏障強度，可作為一種有效的皮膚滲透增強劑[22?24]，使經(jīng)皮給藥達到更好的治療效果。

基于此，本研究制備丙酸氯倍他索脂肪酸囊泡（CP-FAV），通過體外透皮實驗考察CP-FAV 的皮膚透過量和皮內(nèi)滯留量，并考察其透皮機制及抗銀屑病的療效，為增加藥物滲透、延長藥物作用時間等研究奠定理論和實驗基礎(chǔ)，進而為銀屑病經(jīng)皮給藥的臨床推廣提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

RE-5205A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；YB-P6 智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；JY92-2D 超聲細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；STA409PC 差示量熱掃描儀（北京恒久實驗設(shè)備有限公司）；Spectrum100 傅里葉紅外光譜（PerkinElmer公司）。

1.2 材料

油酸（批號：20201130，國藥集團化學試劑有限公司）；丙酸氯倍他索（批號：D1402028，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇（天津科密歐化學試劑廠）；PBS（批號：P1003，pH 7.4 北京索萊寶技術(shù)有限公司）；雙蒸水（實驗室自制）；5%咪喹莫特乳膏（批號：40220702，四川明欣藥業(yè)有限責任公司）；白凡士林（批號：220702，青島錦麟生物科技有限公司）。

1.3 動物

SPF 級健康雄性KM 小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，生產(chǎn)許可證號為SYXK（吉）2020-0002，動物倫理批準文號：JMSU-2023101901。

2 方法與結(jié)果

2.1 CP-FAV的制備

薄膜分散-超聲法制備CP-FAV：精密稱取15 mg 油酸和10 mgCP 溶解于5 mL 甲醇溶劑中，置于干燥的圓底燒瓶中，減壓蒸發(fā)至有機溶劑完全揮干，在瓶壁底部形成均勻薄膜，然后加入PBS（pH7.4）溶液20 mL，室溫條件下水化2 h，探頭超聲14 min（285 W，開啟3 s，關(guān)閉2 s），即得CP-FAV。

2.2 體外透皮研究

2.2.1 離體小鼠皮膚的處理 用刮毛刀和脫毛膏去除小鼠背部毛，將小鼠脫頸處死，用組織剪剝離小鼠背部皮膚，再刮除皮下脂肪，冷凍儲存[25]。

2.2.2 體外透皮試驗 透皮試驗采用Franz擴散池[21]進行。冷凍的鼠皮用PBS（pH 7.4）解凍，用濾紙吸干水分。角質(zhì)層朝向供給池，用固定夾固定，使真皮層與接收液體密切接觸。在測試過程中，在接收池中加入15 mL的接收液，并在供給池中加入待透皮的試劑。有效擴散面積為1.766 cm2，（37.0±0.2）℃恒溫水浴，并以200 r/min 磁力恒速攪拌。以不同的時間間隔精密吸取2 mL接受液樣品，隨即補回相應(yīng)量，樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，計算各時間點單位面積皮膚的累積透過量（Qn）：

式中：Qn為第n個取樣時間點的單位面積累積滲透量；V0為釋放介質(zhì)總體積；Cn為第n個點的藥物濃度；Ci為第i（i=n?1）個點的藥物濃度；Vi為第i次取樣液體積；A為Franz擴散池有效擴散面積。

根據(jù)不同劑型在各時間點的取樣分析結(jié)果，繪制囊泡的累積滲透量（Qn）-時間（t）曲線，見圖1?？梢姡珻P 原料藥溶液和CP-FAV 滲透趨勢基本一致，CP-FAV的累積滲透量高于原料藥溶液，24 h累積透皮量為原料藥溶液的2.88 倍。因此，脂肪酸囊泡不同程度提高了原料藥的皮膚透過率，其釋放相關(guān)方程擬合結(jié)果見表1，其體外滲透過程符合一級模型。

表1 CP-FAV滲透模型擬合結(jié)果Table 1 Fitting results of CP-FAV penetration model

圖1 CP原料藥及CP-FAV體外滲透曲線Figure 1 Penetration curves of Free-CP and CP-FAV（，n=3）

2.2.3 體外皮膚滯留實驗 24 h后從Franz擴散池上取下皮膚，剪掉未接觸藥物的皮膚，生理鹽水去除皮膚表面殘留藥物。充分剪碎皮膚后分別用3 mL無水乙醇提取3 次，合并取上清液，10 000 r/min 高速離心10 min。每組皮膚滯留實驗各進行3 次。按以下公式計算單位面積皮內(nèi)滯留量（Qm）：

式中：Cm為提取液濃度，V為提取液體積，A為經(jīng)皮滲透面積。

結(jié)果測得CP-FAV 皮膚滯留量遠大于CP，24 h皮膚滯留量為（88.79±2.2）mg/cm2，是CP 原料藥溶液的3.37 倍，可能是因為皮膚中含有大量脂肪酸，脂肪酸具有高可溶性，從而提高了藥物的遞送能力以及滯留能力。

2.3 載體對皮膚結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 傅里葉變換紅外光譜圖可以通過皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)和角蛋白次級結(jié)構(gòu)的紅外吸收峰信息反映其結(jié)構(gòu)變化[26]。按照“2.2.1”項方法處理小鼠離體皮膚，PBS（pH 7.4）及空白FAV 溶液2 mL 分別處理小鼠皮膚2 h，將干燥的皮膚樣品和KBr 進行充分的研磨直至粉碎均勻，取適量混合物進行壓片，進行FTIR 光譜分析（分辨率：2?1，掃描次數(shù)：100，掃描范圍：500～4 000 cm?1），光譜圖見圖2。

圖2 不同處理組小鼠皮膚的紅外光譜圖Figure 2 Spectrums of mouse skin in different treatment groups

體外透皮試驗對小鼠皮膚結(jié)構(gòu)的影響主要是角質(zhì)層細胞間的類脂組織，紅外光譜圖中顯示了類脂組織的—CH2?；湹姆磳ΨQ伸縮振動和對稱伸縮振動譜帶，不同載體處理后角質(zhì)層脂質(zhì)和角蛋白振動峰位移變化見表2。

表2 不同載體處理后角質(zhì)層脂質(zhì)和角蛋白振動峰位移變化Table 2 Vibrational peak displacement changes in cuticle lipids and keratins after treatment with different vectorsσ/cm?1

與對照相比，F(xiàn)AV 處理組對稱和不對稱—CH2的伸縮振動值變高，表明脂質(zhì)由有序向無序轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變顯示了角質(zhì)層中脂質(zhì)的流動性增加，從而提高皮膚滲透能力。另外，F(xiàn)AV 處理組中角蛋白吸收峰的峰位產(chǎn)生明顯的藍移，表明處理皮膚后能夠影響角質(zhì)層中角蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，改變角質(zhì)層致密結(jié)構(gòu)而增加其對藥物的通透性[27]。

2.3.2 差示掃描熱分析方法（DSC） 按“2.2.1”項方法處理小鼠腹部離體皮膚，將處理12 h 的皮膚置于?80 ℃冰箱中預(yù)凍1 h，于冷凍干燥機中48 h 進行干燥脫水處理，取4 mg左右干燥后的皮膚樣品置于鋁坩堝中進行測定，考察FAV 對皮膚角質(zhì)層相行為的影響。掃描速率為10 ℃/min，加熱范圍為0～300 ℃。

不同處理組小鼠腹部皮膚DSC結(jié)果見圖3?？梢姡琍SB 處理的皮膚的相轉(zhuǎn)換溫度為78.44 ℃，F(xiàn)AV處理的皮膚的相轉(zhuǎn)換溫度為77.70 ℃。相轉(zhuǎn)變溫度向較低溫度的轉(zhuǎn)變可以作為脂質(zhì)結(jié)構(gòu)混亂的參數(shù)[28]，經(jīng)FAV處理的皮膚的相轉(zhuǎn)變溫度降低，說明增加了類脂質(zhì)組織的流動性，從而使藥物和載體更加容易透過角質(zhì)層。

圖3 不同處理組小鼠腹部皮膚DSC熱譜圖Figure 3 DSC thermogram of abdominal skin of mice in dif‐ferent treatment groups

2.4 體內(nèi)藥效學研究

2.4.1 分組及建立模型 小鼠用苦味酸進行編號后，用刮毛刀刮出約2 cm×3 cm 大小皮膚。隨機分為模型組、空白組、CP-FAV 組及CP 溶液組，每組8只。除空白組小鼠用等量的白凡士林涂抹外，其余各組小鼠背部每日涂抹62.5 mg 的5%咪喹莫特乳膏，1次/d，連續(xù)7 d。造模期間小鼠皮膚起初為境界清楚、形狀大小不一的紅斑，稍有浸潤增厚，后續(xù)發(fā)展為表面覆蓋多層銀白色鱗屑，見圖4。從造模小鼠皮膚形態(tài)看，模型和參考文獻基本一致[29?30]。

圖4 小鼠造模皮膚皮損狀況Figure 4 Conditions of molded skin in mice

2.4.2 銀屑病皮損面積及嚴重程度指數(shù)（PASI） 每日觀察并拍照記錄各組小鼠的皮損變化，參照PASI評分標準。對各組小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度進行評分，并根據(jù)各自的嚴重程度分為1～5級，對應(yīng)0～4分[31]，各組小鼠PASI評分見圖5。

圖5 各組小鼠PASI評分Figure 5 The PASI scores of the mice in each group（，n=3）

可見，與正常組相比，模型組小鼠的背部紅斑面積擴大（t=?4.580，P＜0.05），鱗屑明顯增多（t=?3.663，P＜0.05），皮膚增厚浸潤程度嚴重（t=?4.571，P＜0.01）。經(jīng)各處方組治療后的小鼠紅斑、鱗屑、皮膚增厚浸潤程度均有所下降，其中CP-FAV效果最顯著，與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），在實驗期間觀察到紅斑、鱗屑和皮膚增厚強度進展一致，不同治療組中3 個參數(shù)的嚴重程度降低程度不同。

2.4.3 組織病理學觀察 將小鼠脫頸處死后，剪取相對應(yīng)皮損處組織，固定于10%甲醛中，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色，光學顯微鏡下觀察皮損組織病理形態(tài)并拍照[32]，結(jié)果見圖6?？梢?，空白組小鼠皮膚組織的表皮層薄，細胞浸潤少；模型組小鼠表皮細胞層明顯增厚，真皮層可見大量炎性細胞浸潤，皮損組織呈銀屑病樣改變；CP 組和模型組類似，但是表皮增厚、細胞浸潤程度等都比模型組輕；CPFAV 組小鼠皮損表皮厚度較模型組降低明顯，真皮層炎性細胞浸潤明顯減少，效果較CP組更明顯。

圖6 各組小鼠皮膚組織HE染色結(jié)果Figure 6 Results of HE staining of skin tissue in each group of mice（×100）

3 討論

銀屑病可見于任何年齡段人群，常反復(fù)發(fā)作，亞洲成年人發(fā)病率約為0.14%[33]。經(jīng)皮局部治療最常用激素類藥物，但銀屑病需長期治療，為了改善激素類停藥后易復(fù)發(fā)、遠期療效較差等缺點，本課題提出了暫時還沒有應(yīng)用于臨床治療報道的CP-FAV，并進行了體外經(jīng)皮滲透性和皮膚滯留量實驗。從本文研究結(jié)果看出，與CP 原料藥比較，CP-FAV 可顯著增加藥物的滲透量，提高皮膚表面的藥物滯留量，有利于藥物在皮膚內(nèi)形成藥物儲庫并緩慢釋放，并且皮膚中含有大量的脂肪酸還可以作為生物活性物質(zhì)通過與脂質(zhì)基質(zhì)相互作用來降低皮膚擴散阻力的滲透促進劑[34?35]，提高了其局部治療銀屑病的功效，較普通溶液可以減少使用次數(shù)，降低不良反應(yīng)。同時，本研究還考察了FAV 對皮膚結(jié)構(gòu)的影響作用，結(jié)果顯示FAV 并沒有對皮膚結(jié)構(gòu)造成破壞，而是提高了角質(zhì)層的類脂質(zhì)流動性，促進了藥物在皮膚角質(zhì)層的滲透轉(zhuǎn)移。

咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型可以全面、穩(wěn)定地擬生銀屑病樣臨床表征，是一種操作簡便且較為理想的評估銀屑病藥物治療的實驗動物模型?；阢y屑病PASI 評分和皮膚組織病理學樣本，CPFAV 減少了小鼠皮膚炎癥，并對銀屑病小鼠有顯著的治療作用。

綜上所述，CP-FAV 為銀屑病經(jīng)皮給藥提供了新的劑型選擇，為以后經(jīng)皮給藥的實際應(yīng)用提供一定的參考價值和依據(jù)。

（本文所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。）