茶黃素通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信號通路對HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭永木，蘇亞勇，劉雙平，王麗惠，徐成潤

［中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院（廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院）感染科，福建 漳州 363100］

目前，原發(fā)性肝癌嚴(yán)重威脅人民的生命和健康[1]。由于肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，治療方法也呈多樣化。越來越多的研究表明，中醫(yī)藥在治療癌癥方面有明顯優(yōu)勢，可降低癌癥的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存質(zhì)量[2]。茶黃素（theaflavins）是從紅茶或綠茶中提取的一類天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降脂、抗突變、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等藥理作用，尤其在多種腫瘤中如胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌及乳腺癌等顯示抗腫瘤活性，一度被認(rèn)為是癌癥新藥研發(fā)的新方向[3?5]。本研究通過細(xì)胞實驗探討茶黃素通過調(diào)控Wnt/β-catenin和Hedgehog 信號通路對HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在闡明茶黃素在HepG2 細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，為其抑制肝細(xì)胞癌的基礎(chǔ)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌HepG2 細(xì)胞購于上海酶研生物科技有限公司；茶黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，BP1384）購于成都普瑞法生物技術(shù)有限公司（批號：BP1384）；CCK-8 試劑盒購于Dojindo Molecular Technologies 公司（批號：CK04-11）；GAPDH（批號：P04406，36 kDa）、Ki67（批號：E9PVX6，351 kDa）、PCNA（批號：P12004，31 kDa）、cleaved caspase-3（批號：P42574，32 kDa）、caspase-3（批號：P42574，32 kDa）、cleaved caspase-9（批號：P55211，46 kDa）、caspase-9（批號：P55211，46 kDa）、GLi1（批號：P08151，150 kDa）、SMO（批號：Q99835，86 kDa）、β-catenin（批號：P35222，92 kDa）、c-myc（批號：P01106，49 kDa）和Cyclin D1（批號：P24385，34 kDa）均購于美國Proteintech Group 公司；PTch1（批號：ab53715，161 kDa）購于美國Abcam 公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：88-8102-72）購于美國ThermoFisher 公司；SYBR Premix Ex TaqTM（批號：DRR081A）試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%（φ）胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入肝癌HepG2 細(xì)胞，并將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37 ℃、5%（φ）CO2濃度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 試驗檢測HepG2 細(xì)胞活性 篩選對數(shù)生長期的肝癌HepG2 細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的肝癌HepG2 細(xì)胞進(jìn)行稀釋，取5×104個/L 細(xì)胞接種于96孔板中，用0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的茶黃素分別進(jìn)行處理，每個濃度設(shè)置3個平行孔，然后分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)不同時間段后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃條件下孵育1 h。最后，在450 nm 波長下測量各孔吸光度值（A），以0 μmol/L 茶黃素作為對照組，計算細(xì)胞活性。HepG2 細(xì)胞存活率=（實驗組A 值/對照組A值）×100%。取3次實驗平均值計算存活率。

1.2.3 實驗分組 根據(jù)細(xì)胞活性實驗結(jié)果，篩選對數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，將肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行稀釋，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個/mL，用0、20、40、80 μmol/L 的茶黃素分別培養(yǎng)24 h。實驗分為4 組：空白對照組（不給予任何藥物處理）、茶黃素低劑量（20 μmol/L）組、茶黃素中劑量（40 μmol/L）組和茶黃素高劑量（80 μmol/L）組。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2 細(xì)胞凋亡 篩選對數(shù)生長期的肝癌HepG2 細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的肝癌HepG2 細(xì)胞進(jìn)行稀釋，取5×104個細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。分別添加20、40、80 μmol/L 的茶黃素，孵育24 h 后，然后使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶收集細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和10 μL PI 溶液，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀（美國貝克曼，DxFLEX）檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測mRNA 相對表達(dá)量 取經(jīng)茶黃素（0、20、40、80 μmol/L）處理并培養(yǎng)24 h 的肝癌HepG2 細(xì)胞，用Trizol 裂解液裂解細(xì)胞，然后提取總RNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并制備50 μL 反應(yīng)體系，用于DNA 擴(kuò)增。熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，CFX9 real-time PCR 儀）檢測mRNA 的相對表達(dá)量，PCR 反應(yīng)條件：首先是95 ℃預(yù)變性5 min，然后是95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，以上進(jìn)行35 個循環(huán)處理。用2?ΔΔCt法分析GLi1、SMO、PTch1、β-catenin、c-myc 和Cyclin D1 的mRNA 相對表達(dá)量[6]，取3 次實驗平均值計算結(jié)果。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá)量 將RIPA 裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑按照100∶1 的體積比混合，加入茶黃素處理（0、20、40、80 μmol/L 處理并培養(yǎng)24 h）后的肝癌HepG2 細(xì)胞中，置于冰塊中，裂解30 min，12 000 r/min 離心10 min，離心后，去掉上清液，收集細(xì)胞總蛋白，最后采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將收集的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用現(xiàn)配置的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，然后用TBST 清洗液清洗膜，每次3 min，共3 次。根據(jù)說明書，加入對應(yīng)濃度GAPDH、Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9、GLi1、SMO、PTch1、β-catenin、c-myc和Cyclin D1的一抗，在4 ℃的條件下孵育過夜，再TBST緩沖液，每次3 min，共3次；然后加入對應(yīng)濃度的二抗，在室溫條件下孵育2 h，再TBST緩沖液，每次3 min，共3次。最后在避光的條件下，加入ECL發(fā)光染色，使用凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司，ChemiDocM）進(jìn)行分析，用TotalLab 2.0進(jìn)行灰度計算，GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量，取3次實驗平均值計算結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，LSD-t法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響

如圖1 所示，隨著茶黃素濃度的增加，肝癌HepG2 細(xì)胞活性顯著下降；在相同茶黃素濃度下，隨著培養(yǎng)時間增加，肝癌HepG2 細(xì)胞活性顯著下降。培養(yǎng)24 h，茶黃素濃度為＜80 μmol/L 時，肝癌HepG2 細(xì)胞活性＞70%。因此，本研究選取濃度為20、40、80 μmol/L的茶黃素進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effect of theaflavins on HepG2 cell activity

2.2 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，克隆形成實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，茶黃素顯著抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，其中茶黃素濃度為40 μmol/L和80 μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，Ki67 和PCNA 蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖2 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect of theaflavins on HepG2 cell proliferation

2.3 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，在流式細(xì)胞術(shù)實驗中，與空白對照組相比，茶黃素顯著誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，其中茶黃素濃度為40 μmol/L和80 μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。

圖3 茶黃素對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of theaflavins on HepG2 cell apoptosis

2.4 茶黃素對Hedgehog信號通路的影響

如圖4 所示，qRT-PCR 結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，GLi1、SMO 和PTch1 mRNA 相對表達(dá)量顯著降低。Western blot結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，GLi1、SMO和PTch1蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖4 茶黃素對Hedgehog信號通路的影響Figure 4 Effect of theaflavins on Hedgehog signaling pathway

2.5 茶黃素對Wnt/β-catenin信號通路的影響

如圖5 所示，qRT-PCR 結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，β-catenin、c-myc和Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量顯著降低。Western blot結(jié)果顯示，隨著茶黃素濃度增加，β-catenin、c-myc 和Cyclin D1 蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖5 茶黃素對Wnt/β-catenin信號通路的影響Figure 5 Effect of theaflavins on Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討論

原發(fā)性肝癌具有較高的發(fā)病率和致死率，是全世界最為常見的惡性腫瘤之一[7]。近年來，隨著人們生活、工作等方式的改變、飲食結(jié)構(gòu)的變化以及老年化加劇，導(dǎo)致肝癌的發(fā)病率逐年上升。目前可用于治療肝癌的手段為局部治療（手術(shù)、消融、栓塞、放療）和系統(tǒng)治療（靶向治療、免疫治療、化療），這些方法能顯著改善患者生存期和提高患者生活質(zhì)量，但仍存在局限性，即肝癌治愈率、患者5年生存率普遍較低，因此探索治療肝癌的研究仍然任重道遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步尋找更為有效的治療策略[8?9]。近年來，大量研究證實了茶黃素的生物活性、藥用價值及其保健功能[10]，即其能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞有絲分裂阻滯并調(diào)節(jié)腫瘤免疫，以及通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT、MAPK、NF-κB、JAK/STAT、Hedgehog及Wnt/β-catenin等信號通路抑制腫瘤發(fā)生和生長[4]。

研究表明，Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信號通路在組織生長發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11]。其中Hedgehog（Hh）通路通常在哺乳動物的胚胎發(fā)育、纖毛運動、腫瘤發(fā)生過程中被激活，主要包括3個家族成員及配體Sonic hedgehog（SHh）、Indian hedgehog（IHh）和Desert hedgehog（DHh），12-跨膜受體PTch1 和PTch2，7-跨膜G 蛋白偶聯(lián)受體Smoothened（SMO），轉(zhuǎn)錄因子GLil、GLi2 和GLi3[12?13]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過茶黃素處理后，GLi1、SMO 和PTch1 mRNA相對表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明茶黃素能抑制Hedgehog 信號通路從而調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和凋亡。另外，Wnt/β-catenin 通路中核心蛋白為β-catenin 蛋白，是Wnt 的效應(yīng)器[13]。在本研究中，經(jīng)過茶黃素處理后，β-catenin mRNA 相對表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明茶黃素能抑制Wnt/β-catenin 信號通路從而調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，GLil 是轉(zhuǎn)錄激活因子，它可以誘導(dǎo)內(nèi)源性卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled-related protein-1，SFRP-1），使SFRP-1 表達(dá)量增加。SFRP1 是Wnt 信號通路的負(fù)調(diào)控因子，Hedgehog 通路可通過上調(diào)SFRP1 的表達(dá)量抑制Wnt信號通路相應(yīng)蛋白的表達(dá)量[14]。已證明典型的Hedgehog 信號通過誘導(dǎo)Cyclin D1 和c-myc基因在細(xì)胞增殖中起重要作用，當(dāng)細(xì)胞膜上的PTch1 與配體配對結(jié)合后可以激活Hedgehog 信號通路，誘發(fā)GLi2 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，繼而影響到GLi1、Bcl-2、c-Flip、Cyclin D1、c-myc 及VEGF 靶基因的表達(dá)，從而激發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖[15?16]。在細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞周期中重要調(diào)控蛋白Cyclin D1能加快細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，縮短細(xì)胞增殖周期的時間，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，因此該通路被認(rèn)為是肝癌治療的重要靶點[15?16]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)茶黃素處理后，c-myc和Cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；克隆形成實驗結(jié)果顯示，茶黃素能顯著抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，并且顯著下調(diào)Ki67 和PCNA 蛋白的表達(dá)量。Wnt/β-catenin 信號通路參與了HCC在內(nèi)惡性腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并影響癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，是肝癌發(fā)生發(fā)展的最重要的信號通路之一[13，17]。流式細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，茶黃素顯著誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并且顯著上調(diào)cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)量。

綜上所述，本研究表明茶黃素可以抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、促進(jìn)HepG2 細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信號通路來實現(xiàn)的，未來仍需進(jìn)一步深入驗證該調(diào)控機(jī)制，以期實現(xiàn)茶黃素輔助治療肝癌的臨床應(yīng)用。