GC?MS/MS法同時測定十滴水中4種揮發(fā)性成分的含量

具笑平，吳志國，吳芳花，陳騰輝

（河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517025）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B 氣相色譜儀聯(lián)用7000DEI 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；XS205 電子天平（Mettler Toledo）；超純水系統(tǒng)（默克，Milli?Direct16）。

1.2 試藥

桉油精（批號110788?202108，質(zhì)量分數(shù)99.4%）、樟腦（批號110747?202011，質(zhì)量分數(shù)98.8%）、桂皮醛（批號110710?202223，質(zhì)量分數(shù)98.8%）和反式茴香腦（批號111835?201804，質(zhì)量分數(shù)99.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙醇為色譜純（批號J2209213，阿拉丁公司）；十滴水（批號220808、210703、220906，廣東南國藥業(yè)有限公司；批號S0236，廣西惠寶源制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Agilent HP?5MS UI 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度65 ℃，保持2 min，以每分鐘6 ℃的速率升至150 ℃，保持10 min；進樣口溫度為210 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；流速為1 mL/min；分流比為10∶1；進樣量為1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源（EI），電子束能量為70 eV；傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～500m/z，溶劑延遲6.0 min。監(jiān)測模式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1。

表1 4種組分監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定表Table 1 Monitoring ion pairs and related parameter settings of four components

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備溶液的制備 精密稱取樟腦30 mg 及桉油精、桂皮醛、反式茴香腦對照品各10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解，并定容至刻度，制成對照品儲備溶液（2 ℃下保存，可保存5 d）。

2.2.2 標準系列溶液的制備 精密量取樟腦對照品儲備溶液1.0 mL，其余對照品儲備液0.5 mL，置于同一10.0 mL 的容量瓶中，用70%（體積分數(shù)，下同）乙醇定容至刻度。再精密吸取該溶液適量，配成樟腦對照品質(zhì)量濃度為6、30、60、150、300 μg/mL，其余對照品質(zhì)量濃度為1.0、5、10、25、50 μg/mL 的系列標準溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 精密量取樣品1.0 mL，置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，為樣品溶液I。再精密量取樣品溶液Ⅰ5.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.25 μm 濾膜過濾，濾液為樣品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按十滴水處方配比和制備方法制備缺桉油、樟腦、肉桂、小茴香的陰性對照樣品，再按“2.2.3”項下樣品溶液制備方法制備全陰性對照溶液。同法制備桉油陰性對照溶液、樟腦陰性對照溶液、肉桂陰性對照溶液和小茴香陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液、樣品溶液和陰性對照溶液各1 μL 進行測定，結(jié)果顯示陰性對照品溶液色譜圖中，在各指標成分相應(yīng)保留時間處均無干擾，見圖1。

寒潮天氣過程是一種大規(guī)模的強冷空氣活動過程,寒潮天氣的主要特點是劇烈降溫和大風(fēng),其中較易出災(zāi)且難防范的就是大風(fēng)過程。

圖1 專屬性考察圖譜Figure 1 Spectrograms of specificity test

2.3.2 線性考察 吸取“2.2.2”項下系列標準溶液，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件進樣分析，記錄MRM色譜圖，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 4種成分線性回歸方程和線性范圍Table 2 Linear regression equation and linear range of four components

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下系列標準溶液中質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果得桉油精、樟腦、桂皮醛、反式茴香腦峰面積的RSD 值分別為1.27%、1.35%、1.87%、1.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批（批號：220808）樣品，按“2.2.3”項方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件進樣分析，計算得桉油精、樟腦、桂皮醛、反式茴香腦的質(zhì)量濃度分別為12.356 0、30.311 1、0.823 3、0.418 2 mg/mL，RSD 值分別為1.72%、0.61%、1.86%、1.90%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果得桉油精、樟腦、桂皮醛、反式茴香腦峰面積的RSD 值分別為0.91%、0.65%、1.35%、1.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收試驗 取已知含量（批號：220808）的樣品6 份，每份0.5 mL，分別加入表3 中相應(yīng)的對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 十滴水中4種成分的加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery test of four components in Shidishui（n=6）

2.4 檢測限和定量限

吸取線性關(guān)系考察項下最低質(zhì)量濃度溶液，用70%乙醇稀釋，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件進行測定，記錄MRM色譜圖，分別以最低信噪比3∶1和10∶1時的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限。桉油精的檢出限為25 ng/mL，定量限為75 ng/mL；樟腦的檢出限為10 ng/mL，定量限為30 ng/mL；桂皮醛的檢出限為100 ng/mL，定量限為250 ng/mL；反式茴香腦的檢出限為50 ng/mL，定量限為150 ng/mL。

2.5 樣品的測定

取4 份不同批號樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜?質(zhì)譜條件進樣分析，測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 MS/MS方法的優(yōu)化

先在MS1 掃描模式下掃描，掃描范圍35～500m/z，選取豐度最大的1 個離子作為母離子，確定母離子之后，在MS1?SIM 模式下進行子離子掃描，多次掃描后，選取2個子離子豐度較高且最穩(wěn)定的離子作為定量定性離子，在MRM 模式下，對已獲得精確質(zhì)量數(shù)的母離子作不同碰撞能量（5～30 eV，以2 eV 為間隔），其對應(yīng)的碰撞能量作為離子對的碰撞能量，最后針對樣品中4 種成分的響應(yīng)值調(diào)整與之相適應(yīng)的增益因子。

3.2 指標成分的確定

本研究曾對方中的茴香醛展開考察，確定了相對穩(wěn)定的離子對，優(yōu)化了與之相適宜的碰撞能，線性和精密度均達標，但當對樣品進行茴香醛的測定時，結(jié)果顯示樣品中茴香醛的響應(yīng)低、峰面積小、重復(fù)性差、準確度低，不適宜用本方法測定。

3.3 樣品提取方法的優(yōu)化

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)十滴水樣品中4種成分的含量差異較大，尤其是樟腦和反式茴香腦。如何既可同時準確定量4 種成分，又能使得樣品的稀釋倍數(shù)在合理范圍內(nèi)，是本試驗研究的主要內(nèi)容之一。經(jīng)過實驗摸索及總結(jié)發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整質(zhì)譜參數(shù)的增益因子可以有效地解決該問題，即降低樟腦和桉油精的增益因子，升高桂皮醛和反式茴香腦的增益因子，可同時準確定量4種成分。

3.4 對照品儲備溶液的穩(wěn)定性

試驗對對照品的穩(wěn)定性進行了測定和記錄。數(shù)據(jù)顯示對照品儲備溶液的制備于2 ℃下保存的5 d 內(nèi)各對照品峰面積相接近，于第6 天開始有了較大的變化。

3.5 與現(xiàn)行標準檢測方法比較

《中國藥典》2020 年版一部“十滴水”項下，采用GC 法測定桉油精和樟腦的含量、薄層色譜法鑒別桂皮醛和茴香醛。GC 的靈敏度較差，只能測定樣品中的桉油和樟腦，而無法對樣品中同為重要成分的桂皮醛、反式茴香腦進行測定。本文建立的GC?MS/MS法可一次性同時測定桉油精、樟腦、桂皮醛、反式茴香腦這4 者的含量，發(fā)揮了GC?MS/MS 法靈敏、準確的特點，通過色譜峰的保留時間和二級碎片離子的豐度比同時判定化合物，進一步提高測定的準確性，避免其他成分的干擾。與現(xiàn)行標準檢測方法比更加準確、簡單、快速，可為十滴水的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價提供依據(jù)。