HPLC法測定骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑中7種成分含量

吳謀，莫楚銘，蓬展鵬，劉淑芳，陳繼英

（1.東莞市中醫(yī)院，廣東 東莞 523000；2.東莞市中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523000）

外用中藥制劑在骨科診療過程中起著重要的作用，特別是治療急性軟組織損傷獨(dú)具特色，臨床療效滿意，常用的劑型有敷貼藥、涂擦藥、熱熨藥及熏洗濕敷藥等[1]。近年來，凝膠貼膏劑因具有不容易過敏、容易貼敷、不污染衣服等獨(dú)特優(yōu)勢，備受患者歡迎。

骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑是我院根據(jù)臨床需求研發(fā)的新制劑，處方由牛膝、大黃、黃柏、骨碎補(bǔ)等27味中藥組成，以逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的牛膝和同樣具有逐瘀通經(jīng)并可以涼血解毒的大黃為君藥；補(bǔ)血活血的當(dāng)歸尾，清熱解毒療瘡的黃柏，破血行氣的三棱莪術(shù)，活血散瘀、定痛的乳香，和消腫生肌的沒藥為臣藥；行氣利濕、舒筋活絡(luò)的五指毛桃、絡(luò)石藤、雞骨香、骨碎補(bǔ)等為佐使藥，增強(qiáng)君臣藥的消腫止痛、通絡(luò)之功。具有活血散瘀、消腫止痛功效，用于跌打扭傷、筋骨損傷、積瘀腫痛等軟組織損傷癥。由于處方藥味比較復(fù)雜，對于制劑質(zhì)量控制要求更高，本文建立了骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑中7種主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HPLC測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技公司）；色譜柱為Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical 柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；AUW120D電子分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；PL-S30T 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑（東莞市中醫(yī)院制劑中心提供，批號分別為20230516、20230517、20230518、20230525、20230526、20230527、20230528、20230605、20230606、20230607）；原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110809-201205、110885-201703、110773-201313、110713-201212、110721-201618、110756-201512、110796-201520）；乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck公司）；甲醇為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏，除去背襯及薄膜，精密稱取凝膠膏劑20 g，加入甲醇40 mL，超聲提取30 min，放至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾液離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，置水浴鍋中蒸干，用色譜甲醇充分溶解，定容至10 mL，搖勻，備用，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.172、0.142、0.120、0.168、0.130、0.102、0.154 mg/mL 的混合對照品儲備溶液。精密吸取適量混合對照品儲備液，加甲醇定容至一定量程的容量瓶中，逐級稀釋至不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，各成分質(zhì)量濃度如下：原兒茶酸為172.0、68.8、51.6、34.4、17.2、8.6、3.44 μg/mL，咖啡酸為142.0、56.8、42.6、28.4、14.2、7.1、2.84 μg/mL，阿魏酸為120.0、48.0、36.0、24.0、12.0、6.0、2.4 μg/mL，鹽酸小檗堿為168.0、67.2、50.4、33.6、16.8、8.4、3.36 μg/mL，大黃酸為130.0、52.0、39.0、26.0、13.0、6.5、2.6 μg/mL，大黃素為102.0、40.8、30.6、20.4、10.2、5.1、2.04 μg/mL，大黃酚為154.0、61.6、46.2、30.8、15.4、7.7、3.08 μg/mL。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速：1 mL/min；梯度洗脫（0～13 min，5%A～10%A；13%～15 min，10%A～12%A；15～30 min，12%A；30～32 min，12%A～15%A；32～33 min，15%A～20%A）；柱溫：35 ℃；檢測波長：290 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 方法學(xué)考察[2?10]

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對照品溶液、供試品溶液、大黃陰性對照溶液（按處方取缺大黃的各味藥材，按處方工藝制備大黃陰性樣品，再按“2.1”項(xiàng)方法制備大黃陰性對照溶液）及黃柏陰性對照溶液（按處方取缺黃柏的各味藥材，按處方工藝制備黃柏陰性樣品，再按“2.1”項(xiàng)方法制備黃柏陰性對照溶液），分別按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示供試品溶液色譜圖中相應(yīng)位置上出現(xiàn)混合對照品色譜圖上的原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素和大黃酚7 個成分峰；大黃陰性色譜圖中，未檢出大黃酸、大黃素、大黃酚；黃柏陰性色譜圖中，未檢出鹽酸小檗堿。表明方法專屬性良好，見圖1－3。

圖1 混合對照品（A）和供試品溶液（B）色譜圖Figure 1 Chromatograms of mixed reference solution（A）and test solution（B）

圖2 大黃陰性對照色譜圖Figure 2 Negative control chromatogram of Radix et Rhizoma Rhei

圖3 黃柏陰性色譜圖Figure 3 Negative chromatogram of Cortex Phellodendri Chinensis

2.4.2 最低檢測限（LOD）和定量限（LOQ） 取混合對照品溶液，依次稀釋制成一系列梯度濃度的溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，取峰面積信噪比為1∶3左右，計(jì)算最低檢測限濃度（LOD），取峰面積信噪比為1∶10 左右的濃度為最低定量限濃度（LOQ）。結(jié)果見表1。

表1 骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑中7 種主要成分的LOD和LOQTable 1 LOD and LOQ of seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasm

2.4.3 線性關(guān)系考察 將各質(zhì)量濃度的混合對照品按“2.3”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到7種成分的回歸方程及線性范圍，見表2?？梢姡谠O(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，r＞0.999 0。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一份按“2.1”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液（批號：20230516），按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6 次，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸1.26%、咖啡酸0.37%、阿魏酸0.75%、鹽酸小檗堿0.88%、大黃酸2.54%、大黃素0.57%、大黃酚3.33%，各成分峰面積RSD 均小于5%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸0.58%、咖啡酸0.51%、阿魏酸0.17%、鹽酸小檗堿0.04%、大黃酸0.04%、大黃素0.04%、大黃酚0.04%，各成分保留時間RSD均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液（批號：20230516）于制備后0、2、4、8、10、12 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸2.78%、咖啡酸2.02%、阿魏酸0.04%、鹽酸小檗堿1.92%、大黃酸0.53%、大黃素0.41%、大黃酚3.21%，各成分RSD 均小于3.5%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸1.50%、咖啡酸0.77%、阿魏酸0.13%、鹽酸小檗堿0.29%、大黃酸0.16%、大黃素0.15%、大黃酚0.13%，各成分保留時間RSD 均小于2%，表明12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份同一批號（20230516）的凝膠膏劑，按方法“2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸6.11%、咖啡酸6.35%、阿魏酸5.27%、鹽酸小檗堿7.17%、大黃酸5.44%、大黃素5.85%、大黃酚7.91%，各成分RSD 均小于10%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸0.36%、咖啡酸0.31%、阿魏酸0.10%、鹽酸小檗堿0.147%、大黃酸0.02%、大黃素0.02%、大黃酚0.01%，各成分保留時間RSD均小于1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份同一批號（20230516）供試品約20 g，精密稱定，精密加入已知含量的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定加樣回收率，結(jié)果見表3?？梢?，原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚的平均回收率分別為93.79%、95.86%、96.12%、95.31%、96.58%、107.43%、97.12%，7 種成分的平均回收率均在93.79%～107.43%范圍內(nèi)。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery test

2.4.8 樣品測定 取10 批樣品按“2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑中7種主成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 Results of content determination for the seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasmw/（μg·g?1）

3 討論

骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑7 種主要成分中，小檗堿主要存在于黃柏藥材中；大黃酸、大黃素、大黃酚主要存在于大黃藥材中；阿魏酸存在于當(dāng)歸尾、羌活藥材中。研究過程中發(fā)現(xiàn)，黃柏陰性的色譜圖仍檢出阿魏酸，但阿魏酸峰高比供試品色譜圖峰高低，可判斷阿魏酸也來源于黃柏；咖啡酸在荊芥、澤蘭和紅花中存在；兒茶素在大黃、赤芍中存在。這些藥材是骨傷跌打康復(fù)凝膠膏劑的主要藥效成分，因此這7種成分的含量測定可以用于此制劑的質(zhì)量控制。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對樣品制備的提取方法進(jìn)行了考察，分別比較了水和甲醇作為提取溶劑時提取方式和提取時間的效果，結(jié)果顯示用水提取的供試品溶液的色譜峰雜峰比較多，而甲醇超聲30 min 提取制備出來的樣品雜質(zhì)比較少，色譜峰的重現(xiàn)性比較好。研究過程中還發(fā)現(xiàn)，制劑樣品中的藥粉粒度對成分含量均勻性和重現(xiàn)性的影響比較大，制劑制備的藥粉粒度≥80 目，同一批次的水凝膠貼劑不同取樣點(diǎn)的含量測定偏差比較大，樣品的均勻性較差；制劑制備的藥粉粒度≤100 目，同一批次的水凝膠貼劑含量測定結(jié)果偏差較小，均勻度比較好。因此制劑的藥粉粒度要≤100 目。

由于骨傷跌打康復(fù)凝膠貼膏劑的處方成分比較多，建立的方法的檢測時間較長，希望能繼續(xù)改進(jìn)色譜條件，縮短檢測時間。課題組將繼續(xù)進(jìn)行該制劑的全成分分析，更好地闡釋本制劑的有效成分和控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。