不同產(chǎn)地拐棗七中10種微量元素的含量測定及分析

代木堂，鄧詩風(fēng)，劉麗榮，田臣，安正菊

（銅仁市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，貴州 銅仁 554300）

拐棗七為罌粟殼植物荷青花Hylomecon japonica（Thunb.）Prantl et Kundig 的根和根莖，主要分布在川、陜、鄂地區(qū)，具有祛風(fēng)除濕、通筋活絡(luò)、散瘀消腫和止痛的作用，臨床主要用于治療風(fēng)寒濕痹、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、四肢乏力、胃脘痛等疾病[1?3]。拐棗七屬于“太白七藥”，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄于《陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)（2015 年版）》[4]中。標(biāo)準(zhǔn)中對拐棗七僅采用薄層鑒別進(jìn)行質(zhì)量控制，未有其他質(zhì)控指標(biāo)。拐棗七的主要化學(xué)成分為生物堿類、皂苷類和酚酸類[5?7]，此外還有糖類和微量元素等。微量元素是植物生長中存在的一類必需元素，對植物的生長發(fā)育、新陳代謝都起著重要的作用[8?9]，不僅影響植物的生長，還會(huì)影響服藥者的身體健康，因此對拐棗七中微量元素進(jìn)行研究很有必要。大部分微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，對分析方法的靈敏度和檢出限要求較高，目前常用的檢測方法有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等。電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）相較于上述方法，應(yīng)用更加廣泛，測定靈敏度高，且可以同時(shí)測定多種元素，大大縮短了測定時(shí)間、提高檢測效率。

拐棗七中主要有K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 等10 種微量元素，且不同產(chǎn)地拐棗七中這10 種微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有差異，因此本試驗(yàn)確定選擇其作為研究對象。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10?12]建立ICP-MS法同時(shí)測定18批次不同產(chǎn)地拐棗七藥材中的10種微量元素，并對其進(jìn)行聚類分析（HCA）和主成分分析，全面篩選出拐棗七中的主要特征元素，闡明不同元素之間的相關(guān)性，從而為系統(tǒng)全面地評價(jià)拐棗七藥材的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nexlon350X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國PE 公司）；Muitiwav GO Plus 微波消解儀（美國Anton Paar 儀器公司）；OA-360 智能石墨趕酸儀（廣州格丹納儀器有限公司）；BSA124SCW 萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；100 μL、200 μL、1 mL可調(diào)式移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

K 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，編號(hào)為GBW（E）083297；B單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，BWB2271-2016；Ca單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）083796；Na 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）083295；Mg 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）083299；Al單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）080219；Zn 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）083393；Fe 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）083395；Mn 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）080263；Se 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，GBW（E）080215，上述標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度均為100 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液（Ge 和In標(biāo)準(zhǔn)溶液），質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL，均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；KED 調(diào)諧液購自美國PE 公司；65%硝酸購自美國Merk 公司；水為超純水，Millipore 超純水機(jī)制備，電阻率≥18.3 MΩ/cm。

18批拐棗七藥材均于近2年收集自銅仁市各中藥材市場，且對藥材標(biāo)簽和進(jìn)貨查驗(yàn)進(jìn)行了確認(rèn)，確保產(chǎn)地的準(zhǔn)確性；另外，所有藥材均經(jīng)銅仁市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科安正菊副主任藥師鑒定為罌粟殼植物荷青花Hylomecon japonica（Thunb.）Prantl et Kundig 的干燥根和根莖，為拐棗七藥材正品。藥材來源信息見表1。

表1 拐棗七藥材的來源信息Table 1 Sources of H.japonica

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)：RF射頻功率為1 600 W，等離子體氣體流量為22 L/min；輔助氣體流量為1.8 L/min；霧化氣流速為0.90 L/min；采樣錐為Ni 錐，采樣深度為7.0 mm，樣品提升速率為1.0 L/min；液氬壓力為0.7 MPa；脈沖電壓為800 V；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為40 r/min；樣品沖洗為30 s；延遲為10 s；數(shù)據(jù)采集重復(fù)測定3次，測定時(shí)Ge和In元素作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行校正。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密吸取上述多元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋制成每1 mL中分別含K 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；B 25、50、125、250、500、1 000 ng；Ca 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；Na 25、50、125、250、500、1 000 ng；Mg 25、50、125、250、500、1 000 ng；Al 100、200、500、1 000、2 000、4 000 ng；Zn 25、50、125、250、500、1 000 ng；Fe 100、200、500、1 000、2 000、4 000 ng；Mn 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；Se 5、10、25、50、100、200 ng的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別精密量取內(nèi)標(biāo)Ge 和In 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）各100 μL 置于100 mL 量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為Ge 和In 對照品儲(chǔ)備溶液（1 μg/mL），精密吸取Ge 和In 對照品儲(chǔ)備溶液1 mL 置于10 mL 量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為Ge和In標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 ng/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取拐棗七藥材粉碎，過2號(hào)篩，混勻備用。精密稱取藥材粉末0.5 g，置微波消解罐中，精密加入硝酸8 mL，混勻，置于微波消解儀內(nèi)，按表2中的消解程序進(jìn)行消解。消解完全后，取出消解管進(jìn)行趕酸，酸揮發(fā)至約1～2 mL 時(shí)，用少量超純水轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯材料的50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得供試品溶液。

表2 10種微量元素選擇同位素和內(nèi)標(biāo)元素Table 2 Ten trace element selection isotopes and internal standard elements

表3 微波消解儀的工作條件Table 3 Working conditions of microwave digestion

2.3.2 空白溶液的制備 取微波消解罐，精密加入硝酸8 mL，混勻，置于微波消解儀內(nèi)，按表2中的消解程序進(jìn)行消解。消解完全后，取出消解管進(jìn)行趕酸，酸揮發(fā)至約1～2 mL 時(shí)，用少量超純水轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯材料的50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得空白溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察

取“2.2”項(xiàng)下10 種元素系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管插入100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液中，儀器的進(jìn)樣管插入質(zhì)量濃度從低到高的各混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中，每個(gè)樣品測定3次，用3 次測定值的平均值作為縱坐標(biāo)（Y），相對應(yīng)的進(jìn)樣濃度作為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸。計(jì)算得各元素的線性回歸方程以及相關(guān)參數(shù)見表4。

表4 10種微量元素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 4 Linear equations，correlation coefficient，linearity of ten trace elements

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下10 種微量元素系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的中間質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)測定6 次，記錄信號(hào)強(qiáng)度值，得K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的RSD 值分別為1.08%、1.22%、2.17%、1.25%、2.33%、1.18%、2.76%、3.11%、1.58%、2.05%（n=6），均＜4%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取拐棗七藥材（批號(hào)：210301）約500.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，分別計(jì)算10種微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn和Se元素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16 520、10.24、222.60、862.40、1 660、36.68、55.36、70.21、46.35、0.102 2 mg/kg，RSD 分別為0.86%、1.27%、1.55%、1.33%、1.41%、2.55%、2.79%、3.37%、2.55%、3.35%（n=6），結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取拐棗七藥材（批號(hào)：210301）約500.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件，分別于制備后0、1、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測定，記錄信號(hào)測定值。結(jié)果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的RSD 分別為2.33%、2.62%、2.35%、3.17%、2.78%、3.55%、3.42%、2.95%、3.68%、3.96%（n=9），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取拐棗七藥材（批號(hào)：210301）粉末0.25 g，精密稱定，制備6份。置于消解罐內(nèi)，按照樣品質(zhì)量濃度加入相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液、空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測定，按照外標(biāo)法分別計(jì)算10種微量元素的加樣回收率，結(jié)果各元素的平均回收率和RSD 值分別為K 97.14%、0.71%，B 104.87%、4.17%，Ca 97.08%、1.68%，Na 104.17%、1.49%，Mg 99.21%、1.30%，Al 104.62%、4.39%，Zn 98.46%、1.46%，F(xiàn)e 95.25%、0.84%，Mn 95.92%、1.00%，Se 96.86%、4.73%。表明該方法的加樣回收率良好。

2.9 檢出限和定量限測定

取“2.3”項(xiàng)下的空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，連續(xù)測定11 次，計(jì)算空白溶液中K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的標(biāo)準(zhǔn)偏差s，k為各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以3s/k作為各元素的檢出限，以10s/k作為各元素的定量限。結(jié)果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的檢出限分別為5.316、4.628、2.225、3.022、0.466、2.129、0.762、6.358、0.054、0.326 ng/mL；定量限分別為17.720、15.427、7.417、10.073、1.553、7.097、2.540、21.193、0.180、1.087 ng/mL。

2.10 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

取18 批次拐角七藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下條件下測定（n=3），采用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出上述10 種微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。

表5 拐棗七中10種微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 The mass concentration of ten trace elements of H.japonica（n=3）w/（mg·kg?1）

2.11 聚類熱圖分析

聚類熱圖采用顏色對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布情況進(jìn)行直觀可視化的分析[13]，本研究對18 個(gè)不同產(chǎn)地的拐棗七藥材中10 種微量元素的測定結(jié)果進(jìn)行聚類熱圖分析。由于數(shù)據(jù)最高值和最低值差異較大，因此首先進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。由于Se 元素在多個(gè)產(chǎn)地的藥材中均未檢出，因此剔除Se 元素，將其他結(jié)果數(shù)據(jù)取對數(shù)后導(dǎo)入Hiplot在線數(shù)據(jù)可視化和分析平臺(tái)（https：//hiplot.com.cn/），采用ward 方法，平均Euclidean距離為5時(shí)進(jìn)行聚類，得到聚類熱圖見圖1。圖中顏色從藍(lán)到紅分別代表質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高，18個(gè)不同產(chǎn)地的拐棗七藥材可聚為三大類。其中陜西產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S1～S4）為第一類；湖北產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S8～S11）為第二類；四川產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S5～S7）、湖南產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S12～S13）、浙江產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S14～S15）和安徽產(chǎn)拐棗七（編號(hào)為S16～S18）為第三類。結(jié)果可直觀體現(xiàn)除Se元素外的9 種元素中，K 元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，相同產(chǎn)地的微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相似度較高，不同產(chǎn)地之間差異較大。試驗(yàn)通過聚類分析將樣品分為3 類，對研究拐棗七中微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和區(qū)分不同產(chǎn)地的拐棗七具有重要的意義，可為監(jiān)測市售拐棗七藥材的產(chǎn)地和評價(jià)拐棗七藥材的藥效作用提供技術(shù)參考。

圖1 10種微量元素系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Figure 1 Results of cluster analysis of ten trace elements

2.12 主成分分析

主成分分析（PCA）是一種將原來復(fù)雜的多變量進(jìn)行降維，重新組合成一組新的變量信息[14]，通過少數(shù)幾個(gè)代表性的新變量反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息的分析方法。本試驗(yàn)采用Simca14.1 和SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件對上述18 個(gè)不同產(chǎn)地拐棗七藥材中的10種微量元素測定結(jié)果進(jìn)行PCA。由圖2、表6可以看出前3 種成分的特征值大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到92.462%，表明這3 種成分可以代表原始數(shù)據(jù)92.462%的變量信息，因此對其進(jìn)行因子分析。由表7因子載荷矩陣和圖3可以看出，第1個(gè)主成分因子中K、Ca、Na 的負(fù)荷量較大，第2 個(gè)主成分因子中Al、Mn的負(fù)荷量較大，第3個(gè)主成分因子中Mg的負(fù)載荷量較大，因此可以確定拐棗七中的K、Ca、Na、Mg、Al和Mn為主要特征微量元素。

圖2 18批樣品中10種微量元素的PCA得分圖Figure 2 The PCA score plot of ten trace elements of 18 batches of samples

圖3 10種微量元素的主成分分析碎石圖Figure 3 The gravel plot of principal component analysis of 10 trace elements

表6 主成分的初始特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 6 Initial eigenvalue and variance contribution rate of principal components

表7 3種主成分的因子載荷矩陣Table 7 Factor loading matrix of three principal components

3 討論

拐棗七藥材中含有多種微量元素，微量元素不僅參與植物的生理代謝，也是植物次生代謝產(chǎn)物的構(gòu)成因子，其元素的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對中藥的臨床藥效發(fā)揮具有一定的作用[15]，因此微量元素也可以作為中藥質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)之一。目前微量元素的測定主要采用原子吸收光譜法，原子吸收測定較慢，且由于不同產(chǎn)地的藥材所含微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，每種元素都需要可發(fā)射特定波長的燈，且只能逐個(gè)測定，這就導(dǎo)致測定效率較低、耗時(shí)較長。電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）在多種元素的測定中具有較大優(yōu)勢，可以同時(shí)測定且分析速度快、靈敏度和準(zhǔn)確度較高，因此可以用于中藥材中多種微量元素的同時(shí)測定。

本研究測定18 個(gè)不同產(chǎn)地拐棗七藥材中10 種微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用PCA 對其進(jìn)行綜合評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地拐棗七中微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，而相同省份拐棗七中微量元素差異較小。湖北蘄州鎮(zhèn)產(chǎn)的拐棗七中K、Ca、Na 和Fe 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于其他地區(qū)；Se 元素僅在陜西省四縣及浙江省兩市的藥材中有檢出，其他產(chǎn)地均未檢出；K、Na 和Mg 3 種元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于其他元素，K 元素最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到37 032 mg/kg，Mg 元素為2 904 mg/kg，Na 元素為2 604 mg/kg。分析可能因?yàn)镵 是植物生長的必需元素，可增強(qiáng)光合作用，維持細(xì)胞的正常含水量，提高植物的抗旱和缺寒能力；Mg是構(gòu)成葉綠素的主要元素；Na是植物生長的功能性元素，對植物的生長具有刺激作用[16]；且這3種元素在植物生長中發(fā)揮主要作用。由于其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在測定時(shí)對供試品溶液進(jìn)行了2次稀釋，保證樣品所測值在線性范圍及結(jié)果的準(zhǔn)確性。不同產(chǎn)地微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異可能與當(dāng)?shù)氐耐寥?、氣候以及生態(tài)環(huán)境有關(guān)，因此評價(jià)藥材質(zhì)量的優(yōu)劣需要綜合考慮。

目前，市售中藥材存在問題較多，主要有混雜、質(zhì)量退化、造假等。本試驗(yàn)建立了ICP-MS 法同時(shí)測定不同產(chǎn)地18批次拐棗七中K、Ca、Na等10種微量元素含量的分析方法。試驗(yàn)選取了不同省份產(chǎn)的18批次拐棗七藥材作為研究對象，運(yùn)用本試驗(yàn)建立的方法檢測上述拐棗七藥材中10 種微量元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并通過聚類分析研究不同產(chǎn)地拐棗七藥材中K、Ca、Na 等10 種微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異。通過此研究，為監(jiān)測市售拐棗七藥材的產(chǎn)地、評價(jià)拐棗七藥材的質(zhì)量水平提供了技術(shù)參考。