霧水葛總黃酮的提取工藝優(yōu)化及其對(duì)線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響

吳冬凡，李美其，王艷

（廣東藥科大學(xué)廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

霧水葛為蕁麻科植物霧水葛Pouzolzia zeyl‐anica（L.）Benn.的帶根全草，為嶺南特色藥材，具有清熱解毒、清腫排膿、利水通淋等功效，主要用于治療瘡瘍癰疽、乳癰、風(fēng)火牙痛、痢疾、腹瀉、小便淋痛、白濁、消腫毒排膿[1?2]。

研究表明霧水葛的主要活性成分為黃酮、木脂素、萜類等，且黃酮類化合物大多為黃酮苷類[3?4]。黃酮類化合物在抗感染、抑制腫瘤、保護(hù)血管等方面發(fā)揮著重要的作用[5?8]。Wang Lujun等[9]用2，2-二苯基-1-苦基肼自由基清除法和鐵還原抗氧化法測(cè)得總黃酮、酚類具有較好的抗氧化性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，隨著年齡增長(zhǎng)，體內(nèi)代謝速度變得緩慢，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[10]。而當(dāng)機(jī)體內(nèi)的ROS 過(guò)量時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物分子功能造成重大損傷，進(jìn)而直接或間接導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生[11?12]。因此，研究改善氧化損傷所造成的衰老及衰老疾病的天然抗氧化物，對(duì)延緩衰老和預(yù)防相關(guān)疾病的產(chǎn)生有很大好處[13]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)是研究衰老的經(jīng)典生物模型，具有體型小、壽命短、基因組完全測(cè)序，以及含有超過(guò)65%的人類疾病相關(guān)基因等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此在抗氧化和延緩衰老研究領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于抗衰老、藥物篩選和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等各方面的研究[15]。因?yàn)樾沱愲[桿線蟲(chóng)在衰老過(guò)程中表現(xiàn)出許多和人類高度相似的特征，包括神經(jīng)退化、運(yùn)動(dòng)能力減退和降低免疫力等，因此本試驗(yàn)選用霧水葛總黃酮喂食秀麗隱桿線蟲(chóng)，通過(guò)對(duì)其壽命、運(yùn)動(dòng)能力、應(yīng)激實(shí)驗(yàn)等方面進(jìn)行研究，探究霧水葛總黃酮的抗衰老作用機(jī)理，以期為霧水葛進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），THZ-300 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），WGZ-XT 智能細(xì)菌濁度儀（杭州齊威儀器有限公司），AS5150A 超聲波清洗機(jī)（天津奧特塞恩斯儀器有限公司），TDL80-2B 臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司），U-3900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（株式會(huì)社日立制作所），SHA-B 恒溫水浴搖床（常州澳華儀器有限公司），HPX-9082MBZ 恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SMZB4連續(xù)變倍體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司），KB-1102G2光照振蕩培養(yǎng)箱（匡貝實(shí)業(yè)上海有限公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

蘆丁對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)：153.18.4），野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)（N2）于2022 年11月購(gòu)于廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，大腸桿菌E.coilOP50（山東中科嘉億生物工程有限公司，ATCC11411），蛋白胨（北京奧特星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），酵母浸膏、MRS 肉湯（廣東環(huán)凱生物科技有限公司），NGM培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑S2229（山東拓普生物工程有限公司），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

霧水葛藥材于2022 年6 月購(gòu)于中山市仙逸堂中藥飲片有限公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院何夢(mèng)玲副教授鑒定為正品蕁麻科植物霧水葛Pouzolzia zeylanica（L.）Benn。

2 方法

2.1 霧水葛總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 藥材前處理：將霧水葛全草用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，混勻，得到霧水葛細(xì)粉。分別在2個(gè)1 000 mL圓底燒瓶中加入50 g霧水葛細(xì)粉，按料液比1∶8 加入400 mL 石油醚，回流1 h，抽濾除去石油醚，濾渣加入400 mL 石油醚，繼續(xù)回流1 h，抽濾除去石油醚，將2 份濾渣合并混勻，將細(xì)粉放入鼓風(fēng)干燥箱中，于30 ℃揮干石油醚后，收集于干凈錐形瓶中密封，備用[16]。

取霧水葛脫脂粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，平行3 份，按料液比1∶8 加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇8 mL，在80 ℃、240 W 下，超聲提取1 h，提取2次，抽濾，合并濾液。使用旋蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，并經(jīng)4 000 r/min 離心15 min，收集上清液于20 mL容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的供試品溶液。

2.1.2 蘆丁對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.8 mg，置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.216 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.3 顯色反應(yīng) 參照李曉雪等[17]的方法，分別量取對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 mL 分別置于6 個(gè)25 mL容量瓶中，加95%乙醇至10 mL，加5%（質(zhì)量濃度）NaNO2溶液1 mL，搖勻。放置5 min 后，加10%（質(zhì)量濃度）Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加入4%（質(zhì)量濃度）NaOH 溶液10 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻，放置15 min顯色。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 分別精密吸取蘆丁對(duì)照品、供試品溶液各5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色操作，經(jīng)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在400～800 nm的吸收波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)為507 nm。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于6個(gè)25 mL容量瓶中，使蘆丁的質(zhì)量濃度分別為0、0.017、0.034、0.051、0.068、0.102 mg/mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作。以第1 個(gè)容量瓶的溶液為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)上測(cè)定各質(zhì)量濃度溶液的吸光度，用空白對(duì)照組調(diào)零，每組平行操作3次，以質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=12.664ρ+ 0.002 2，r=0.999 8，結(jié)果顯示，蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)具有較好線性關(guān)系。

2.1.6 方法學(xué)考察

2.1.6.1 精密度試驗(yàn) 量取蘆丁對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，在最大吸收波長(zhǎng)507nm 測(cè)定A 值，重復(fù)操作6 次，結(jié)果RSD為1.619%，表明方法精密度良好。

2.1.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取供試品溶液2 mL，置于25 mL 容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，在0、15、30、45、60 min 時(shí)，分別在507 nm 測(cè)定A 值，結(jié)果RSD為2.100%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.1.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別量取供試品溶液2 mL 6份，置于6個(gè)25 mL 容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，在507 nm 測(cè)定A 值，結(jié)果RSD 為0.532%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 分別量取供試品溶液2 mL、蘆丁對(duì)照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，搖勻，操作6份。按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，在507 nm測(cè)定A 值，代入“2.1.5”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD值為1.43%，表明方法加樣回收率較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 霧水葛中總黃酮的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery of total flavonoids of Pouzolzia zeylanica（L.）Benn

2.1.7 霧水葛總黃酮提取率的測(cè)定 將測(cè)得的吸光度代入回歸方程，計(jì)算出提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度，再根據(jù)公式（1）計(jì)算出霧水葛總黃酮的提取率。

式（1）中，c為測(cè)得的吸光度；b、k為回歸方程參數(shù)；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，單位為mL；m為樣品質(zhì)量，單位為mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 單因素試驗(yàn)方法 按表2所示條件，進(jìn)行霧水葛總黃酮提取，抽濾，合并濾液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，并以4 000 r/min離心15 min，收集上清液于20 mL容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的供試品溶液，每個(gè)因素水平重復(fù)提取3次。按“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色、測(cè)定，計(jì)算總黃酮提取率。

表2 單因素試驗(yàn)因素表Table 2 Single-factor table

單因素考察結(jié)果表明，霧水葛中總黃酮的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)有最大提取量。總黃酮提取率隨料液比增加而升高，當(dāng)料液比增大至1∶32時(shí)達(dá)最大值，后趨于平緩的趨勢(shì)?？傸S酮提取率隨溫度增加而升高，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，此時(shí)總黃酮質(zhì)提取率達(dá)最大值?？傸S酮提取率在提取時(shí)間為30～50 min 時(shí)，隨時(shí)間增加而升高，在50 min 后總黃酮提取率開(kāi)始下降。

2.3 正交法優(yōu)化霧水葛總黃酮提取工藝

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了更好考察超聲法的工藝參數(shù)對(duì)霧水葛總黃酮提取的影響，根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素，以霧水葛總黃酮提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定霧水葛總黃酮的最佳提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4－5。

表3 霧水葛總黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Orthogonal experimental factor level of total flavo‐noids of Pouzolzia zeylanica（L.）Benn

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 L9（34）Orthogonal experimental results

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis table

由表可知，霧水葛總黃酮提取率影響因素按大小排序?yàn)镈＞C＞B＞A，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。最佳提取工藝參數(shù)為A1B3C2D3，即：提取時(shí)間為40 min，提取溫度為70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶40 g/mL。

由表4可知，A、B、C、D 4個(gè)因素F值均大于F0.01（2，2）=99，說(shuō)明提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比這4 個(gè)因素對(duì)霧水葛總黃酮提取率的影響都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因此選擇這4 個(gè)因素作為霧水葛總黃酮提取工藝的考察指標(biāo)合理。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取霧水葛脫脂粉末1.0 g置于錐形瓶中，按料液比1∶40加入70%乙醇，在60 ℃、240 W條件下，超聲提取40 min，共2 次，抽濾，合并濾液。使用旋蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，并經(jīng)4 000 r/min 離心15 min，收集上清液于20 mL 容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 的供試品溶液，重復(fù)提取3 次。按“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色、測(cè)定，計(jì)算總黃酮提取率。

結(jié)果顯示，在最佳提取條件下霧水葛總黃酮提取率可達(dá)1.306%，比正交試驗(yàn)中最高提取率相對(duì)升高7.76%，RSD=0.63%，表明該提取工藝可靠穩(wěn)定。

2.4 線蟲(chóng)試驗(yàn)

2.4.1 溶液的配制 NGM培養(yǎng)基：稱取NGM培養(yǎng)基2.26 g于三角瓶中，加入超純水100 mL，加熱煮沸至完全溶解，于120 ℃高壓滅菌15 min后，將培養(yǎng)基置于60 ℃水浴鍋中恒溫1 h，加入配套添加劑A 液、B液各1瓶，搖勻，分裝于已滅菌培養(yǎng)皿中，冷凝備用。

M9 緩沖液：稱量NaCl 5 g、KH2PO43 g、Na2HPO4·12H2O 15.12 g，用超純水定容至1 000 mL，分裝，高壓蒸汽滅菌，備用。

線蟲(chóng)凍存液：取甘油與超純水按體積比1∶1 混合得50 mL，分裝到試管，于120 ℃高壓滅菌15 min，冷卻備用。

裂解液：稱量NaOH 4.0 g 溶解于100 mL 超純水中，與次氯酸鈉溶液按體積比1∶1混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.4.2 食物大腸桿菌E.coil OP50 的培養(yǎng) 將大腸桿菌E.coil OP50 甘油保種液劃板于LB 固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接種于10 mLLB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、轉(zhuǎn)速為130 r/min的恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)10 h，取出，轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，在8 000 r/min 下，離心1 min，倒掉上清液，加入滅菌超純水重懸，洗滌2次，調(diào)整菌液A值至0.4～0.6。

2.4.3 線蟲(chóng)的復(fù)蘇和保種 將線蟲(chóng)凍存液從?80 ℃冰箱取出，放在4 ℃冷藏室融化。吸取200 μL 線蟲(chóng)凍存液于含OP50 的NGM 培養(yǎng)基（涂布OP50 時(shí)，涂布面積要與培養(yǎng)皿留一定的空隙，避免線蟲(chóng)爬上玻璃皿壁而缺水死亡）中，幾分鐘后就可以看到有線蟲(chóng)開(kāi)始爬行。復(fù)蘇培養(yǎng)3 d 后，培養(yǎng)基上會(huì)長(zhǎng)出大量線蟲(chóng)，通過(guò)切塊將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到新的含OP50 的NGM培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代。

用M9 緩沖液4 mL 將同期化或產(chǎn)卵高峰期后培養(yǎng)2 d 的線蟲(chóng)從NGM 培養(yǎng)基沖洗下，收集于滅菌的15 mLEP 管中，于2 000 r/min 離心1 min，棄上清液，再加入M9 緩沖液4 mL 重懸清洗2 次，棄上清液，在沉淀中加入M9 緩沖液1 mL，按1∶1（體積比）加入50%甘油，混勻，分裝于2 mL 凍存管中，用封口膜封口。將凍存管放入泡沫箱中，再將箱子放入?80 ℃冰箱凍存，避免速凍導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。

2.4.4 線蟲(chóng)的同期化 用M9 緩沖液2 mL 沖洗處于產(chǎn)卵高峰期的NGM 板，共沖洗2 次并收集于15 mL尖頭EP 管中，自然沉降后，棄上清液，繼續(xù)用M9 緩沖液4 mL 反復(fù)沖洗2 次，棄上清液。然后加入M9緩沖液2 mL、裂解液2 mL，振蕩3 min，以5 500 r/min 離心30 s，棄上清液。加入M9 緩沖液2 mL 進(jìn)行重懸清洗，以5 500 r/min離心1 min，棄上清液，重復(fù)沖洗2次充分除去裂解液，在沉淀中加入M9緩沖液1 mL，置于20 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h。待卵孵化后，轉(zhuǎn)移至含有OP50 的NGM 培養(yǎng)基中，每個(gè)板上分裝溶液400 μL，即可得到同期化線蟲(chóng)。

2.4.5 霧水葛提取液對(duì)OP50 生長(zhǎng)的影響 將大腸桿菌甘油保種液劃板于LB 固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min 的恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)10 h，取出。將3瓶已滅菌20 mL LB 培養(yǎng)基分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2，在空白組中加入400 μL上述培養(yǎng)好的菌，在實(shí)驗(yàn)組1 加入400 μL 上述培養(yǎng)好的菌和800 μL總黃酮質(zhì)量濃度為0.450 mg/mL 霧水葛的提取液，實(shí)驗(yàn)組2 加入400 μL 上述培養(yǎng)好的菌和400 μL 總黃酮質(zhì)量濃度為0.450 mg/mL 霧水葛的提取液，混勻，吸取2.5 mL在600 nm處測(cè)量其吸光度值。余下溶液將瓶口密封放在37 ℃、轉(zhuǎn)速為130 r/min 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。每隔一小時(shí)吸取2.5 mL，在600 nm處測(cè)量其吸光度值，共6 次，將3 組菌液分別減去初始吸光度值，繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線[18]。見(jiàn)圖1。

圖1 總黃酮提取液對(duì)OP50生長(zhǎng)的影響Figure 1 The effect of total flavonoid extract on the growth of OP50

由結(jié)果可知，霧水葛總黃酮提取物并無(wú)明顯抑制OP50 生長(zhǎng)的情況，在1 h 之后，空白組和實(shí)驗(yàn)組的OP50 均進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。因此，霧水葛總黃酮提取液不會(huì)導(dǎo)致線蟲(chóng)產(chǎn)生熱量限制而出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。

2.4.6 含藥培養(yǎng)基的配制 將霧水葛總黃酮提取物過(guò)微孔濾膜除菌，用滅菌超純水將提取液稀釋成總黃酮質(zhì)量濃度為0.450 mg/mL 的提取液，分別與OP50 菌液按體積比1∶2 混合配制成總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.300（實(shí)驗(yàn)組1）、0.225 mg/mL（實(shí)驗(yàn)組2）的霧水葛總黃酮溶液，吸取400 μL 涂布于NGM 培養(yǎng)基上，即得。

2.4.7 霧水葛總黃酮提取液對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響將同期化的線蟲(chóng)培養(yǎng)3 d后，用挑蟲(chóng)器挑取20條線蟲(chóng)至分別含有0 mg/mL、0.225 mg/mL、0.300 mg/mL霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養(yǎng)基中，每組3 個(gè)板。培養(yǎng)3 d 之后，挑取線蟲(chóng)放在10 μLM9 緩沖液中，觀察并記錄10 s線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)的次數(shù)。

結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，與空白組相比，0.300 mg/mL霧水葛總黃酮增加線蟲(chóng)頭的擺動(dòng)次數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮能增加線蟲(chóng)頭擺動(dòng)次數(shù)，但與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮組與0.225 mg/mL霧水葛總黃酮組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加霧水葛總黃酮給藥量能增加線蟲(chóng)頭擺動(dòng)次數(shù)。

圖2 總黃酮提取液對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Figure 2 The effect of total flavonoid extract on locomotor ability of nematode

2.4.8 H2O2誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激試驗(yàn) 將同期化的線蟲(chóng)培養(yǎng)3 d 后，用挑蟲(chóng)器挑取30 條線蟲(chóng)至分別含有0、0.225、0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養(yǎng)基中，每組3個(gè)板。培養(yǎng)3 d之后，將各培養(yǎng)基中的線蟲(chóng)重新挑到空白培養(yǎng)基中，然后在各培養(yǎng)基中加入0.2%的30%H202溶液1 mL，開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1 h 計(jì)數(shù)1 次，挑出死亡線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)，直至線蟲(chóng)全部死亡（丟失、貼壁的線蟲(chóng)為異常數(shù)據(jù)，不計(jì)入死亡統(tǒng)計(jì)中），繪制線蟲(chóng)存活時(shí)間曲線[19]。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 急性氧化應(yīng)激下不同質(zhì)量濃度總黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響Table 6 Effects of total flavonoids extracts with different mass concentrations on the lifespan of cryptomeria elegans under acute oxidative stress

結(jié)果表明，在急性H2O2氧化損傷下，與空白組比較，0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮能提高線蟲(chóng)的平均壽命、中位壽命及最高壽命，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，平均壽命延長(zhǎng)率達(dá)32.28%；0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮能提高線蟲(chóng)的平均壽命、中位壽命及最高壽命，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的霧水葛總黃酮能提高線蟲(chóng)對(duì)H2O2的耐受力，從而延長(zhǎng)壽命。線蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 總黃酮提取液抗線蟲(chóng)氧化應(yīng)激作用的影響Figure 3 The effect of total flavonoid extract on antioxidative stress of nematodes

2.4.9 熱應(yīng)激試驗(yàn) 將同期化的線蟲(chóng)培養(yǎng)3 d 后，用挑蟲(chóng)器挑取30 條線蟲(chóng)至分別含有0、0.225、0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養(yǎng)基中，每組3 個(gè)板。培養(yǎng)3 d 之后，將各培養(yǎng)基中的線蟲(chóng)重新挑到空白在培養(yǎng)基中，放置于35 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行應(yīng)激，每隔1 h計(jì)數(shù)1次，挑出死亡線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)，直至線蟲(chóng)全部死亡（丟失、貼壁的線蟲(chóng)為異常數(shù)據(jù)，不計(jì)入死亡統(tǒng)計(jì)中），繪制線蟲(chóng)存活時(shí)間曲線。結(jié)果見(jiàn)表7、圖4。

圖4 總黃酮提取液抗線蟲(chóng)熱應(yīng)激作用的影響Figure 4 The effect of total flavonoid extract on the heat stress resistance of nematodes

表7 急性熱應(yīng)激下不同質(zhì)量濃度總黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響Table 7 Effects of total flavonoids extracts with different mass concentrations on the lifespan of cryptomeria elegans under acute heat stress

由結(jié)果可知，在急性熱應(yīng)激損傷下，與空白組比較，0.300 mg/mL霧水葛總黃酮組線蟲(chóng)能增加線蟲(chóng)的平均壽命、中位壽命及最高壽命，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，平均壽命延長(zhǎng)率達(dá)42.96%。0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮組線蟲(chóng)的平均壽命、中位壽命及最高壽命也高于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明霧水葛總黃酮能增強(qiáng)線蟲(chóng)抗熱應(yīng)激的能力，但受劑量影響。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

在單因素考察試驗(yàn)中，因?yàn)殪F水葛中的黃酮化合物主要為黃酮苷，水溶性比脂溶性稍好，所以當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%時(shí)，提取液中的成分更多為脂溶性成分，脂溶性成分溶出率提高會(huì)影響總黃酮的提取，從而使總黃酮提取率降低。剛開(kāi)始料液比升高時(shí)總黃酮提取率也會(huì)升高，可能是因?yàn)樗幉呐c溶劑之間的濃度差升高，接觸面積增大，有利于總黃酮從藥材中溶出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶32時(shí)，藥材中的總黃酮基本被提取出來(lái)，繼續(xù)升高料液比可能會(huì)導(dǎo)致其他物質(zhì)的溶出從而抑制總黃酮提取，加之后續(xù)抽濾、濃縮的時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，工作成本升高。霧水葛總黃酮提取率隨提取時(shí)間、溫度升高先升高后降低，因?yàn)榧訜崮軌虼龠M(jìn)霧水葛中總黃酮的溶出，提取時(shí)間過(guò)短，藥材中的總黃酮還沒(méi)有完全溶出，但提取溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致某些成分被破壞分解，總黃酮提取率下降。

食物減少會(huì)出現(xiàn)熱量限制，影響胰島素樣生長(zhǎng)因子通路的作用，使線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)。為避免因霧水葛總黃酮提取物抑制OP50 生長(zhǎng)而出現(xiàn)線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)的假陽(yáng)性結(jié)果，故將霧水葛總黃酮提取物與OP50混合培養(yǎng)，觀察在飼喂霧水葛總黃酮提取液時(shí)食物是否達(dá)到熱量要求。由結(jié)果可知，霧水葛總黃酮不會(huì)抑制OP50生長(zhǎng)。

隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞氧化損傷而引起其抗氧化功能紊亂。氧化應(yīng)激在衰老相關(guān)疾病發(fā)作中起著重要作用，抗氧化劑能夠減弱或預(yù)防衰老所帶來(lái)的影響[20]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物通過(guò)作用于部分信號(hào)通路分子調(diào)控機(jī)體抗氧化[21]。線蟲(chóng)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗逆性和新陳代謝，符合衰老的自由基理論，近年來(lái)被廣泛用作研究氧化應(yīng)激和衰老的模式生物。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，線蟲(chóng)的彎曲速度會(huì)明顯變慢，所以運(yùn)動(dòng)能力是反映線蟲(chóng)衰老的主要指標(biāo)之一；通過(guò)觀察線蟲(chóng)頭部一定時(shí)間內(nèi)的擺動(dòng)次數(shù)可以直觀判斷線蟲(chóng)的衰老程度。本研究結(jié)果顯示，給藥組線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)次數(shù)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明霧水葛總黃酮具有一定的抗衰老作用。