南瓜子飲片標準湯劑的制備及質量標準的研究

唐雙燕，魏家保，蔡素琴，詹智洪，黃凱偉，趙偉志，張輝

（1.華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000；2.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000）

南瓜子為葫蘆科南瓜屬植物南瓜Cucurbita moschata（Duch.）Poiret.的種子，具有通便驅蟲之功效，可用于大便秘結、腸道絲蟲、蟯蟲、蛔蟲、絳蟲等。南瓜子中富含氨基酸、蛋白質、多糖、多不飽和脂肪酸和礦物質等[1?4]，其中氨基酸是其最主要的活性成分?，F代藥理研究也表明南瓜子中氨基酸類成分可以改善腦血管的流通，調節(jié)腦神經，還可以調節(jié)血壓，維持人體正常的代謝需要，合成人體內的免疫球蛋白，從而起到保護機體、提高人體免疫力的作用[5?10]。因此，南瓜子中的氨基酸成分是其發(fā)揮良好的藥理作用的關鍵所在[11]。查閱目前南瓜子藥材的質量標準收載情況，如《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準（維吾爾藥分冊）》、《甘肅省中藥材標準（2009年版）》、《山東省中藥材標準（2002 年版）》[12?14]等僅收載南瓜子性狀、顯微等項，缺少系統的質量控制方法，且化學成分的研究主要集中在南瓜子氨基酸的測定方面[15?20]，所建立的質量標準相對單一，并不能準確反映中藥材和中藥制劑的質量。因此有必要對南瓜子的質量標準展開深入的研究，為南瓜子的應用以及配方顆粒的研究提供依據和參考。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)藥理論指導下，按照中醫(yī)臨床處方配方后供患者沖服使用，其臨床療效應當和相應的飲片保持一致。為加強中藥配方顆粒質量管理，國家藥品監(jiān)督管理局2021年1 月公布了《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[21?24]，明確了標準湯劑為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質基準。中藥標準湯劑為遵循中醫(yī)藥理論，由不少于15批有代表性的原料，經炮制加工后，分別按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經適當濃縮制得或經適宜方法干燥制得。本研究以傳統湯劑的煎煮方法為基準，建立以出膏率、指標成分苯丙氨酸的質量分數及轉移率、薄層色譜以及特征圖譜為評價指標的質量標準，為南瓜子配方顆粒標準的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000 色譜系統，包括LPG-3400SDN 四元梯度輸液泵、WPS-3000SL 自動進樣器、TCC-3000SD 色譜柱溫箱、DAD-3000二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 7色譜管理系統（賽默飛世爾科技有限公司）；ME36S 百萬分之一分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；XSE205十萬分之一分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；SK5200H 超聲波儀（上?？茖С晝x器有限公司）；500 W 自動型砂鍋（深圳市一枚王電子商務有限公司）；HH-8恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；DHG 9240AGZ 熱風循環(huán)烘箱［中儀國科（北京）科技有限公司］；YRE-501旋轉蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責任有限公司）；GOLD-sim冷凍干燥機（青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司）；DFY-600C 中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試劑、試藥

南瓜子對照藥材（批號：330023-202301）購于上海鴻永生物科技有限公司；苯丙氨酸（批號：140676-201706，質量分數100%）、酪氨酸（批號：140609-202215，質量分數100%）、丙氨酸（批號：140680-202207，質量分數99.9%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水；正丁醇、冰乙酸、乙醇、茚三酮、甲醇等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

15批南瓜子分別來源于安徽亳州、安徽阜陽、山東濰坊、山東濟南和河南商丘，并經安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為葫蘆科植物南瓜Cucurbita moschata（Duch.）Poiret.的干燥成熟種子。詳細信息見表1。

表1 15批南瓜子信息表Table 1 The information of 15 batches of pumpkin seeds

2 方法與結果

2.1 標準湯劑的制備

依據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[24]和《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》[25]中相關要求制備南瓜子飲片標準湯劑。

取南瓜子藥材，除去雜質，取約100 g，搗碎（破碎度不低于90%），置砂鍋中，加入8 倍水浸泡30 min，先武火煮沸，再文火煎煮30 min，200目濾布趁熱濾過；藥渣再加6 倍水，武火煮沸后，再文火煎煮25 min，200 目濾布趁熱濾過，合并濾液，濾液減壓（65 ℃）濃縮至料液比接近1∶（3～5）濃浸膏，置于冷凍干燥機中干燥，即得南瓜子飲片標準湯劑。15批南瓜子飲片均按以上方法制備成標準湯劑。

2.2 出膏率的測定

將15批飲片制備成標準湯劑，每批飲片平行制備2 份。測定各批次標準湯劑的出膏率，結果見表2。

表2 15批南瓜子飲片標準湯劑出膏率及范圍Table 2 Extraction rate and range of 15 batches of pumpkin seed standard decoction

2.3 TLC的鑒別

南瓜子飲片標準湯劑中水溶性成分以氨基酸類成分居多，結合南瓜子藥材的化學成分種類，對制備的15批南瓜子飲片標準湯劑建立薄層鑒別方法。

取南瓜子飲片標準湯劑0.3 g，研細，加稀乙醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丙氨酸對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020年版“通則0502”）試驗，分別吸取上述2 種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-甲醇-冰乙酸-水（15∶4∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置白光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。15 批南瓜子飲片標準湯劑薄層色譜圖信息全面，斑點清晰。各批次均能達到良好的分離效果，見圖1。

圖1 南瓜子15批飲片標準湯劑的TLC色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of 15 batches of standard decoction of pumpkin seeds

2.4 質量分數測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫（0～10 min，0%A→4%A；10～35 min，4%A→7%A；35～42 min，7%A→22%A；42～50 min，22%A→36%A）；檢測波長為210 nm；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；理論塔板數按苯丙氨酸峰計算應不低于3 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取苯丙氨酸對照品適量，精密稱定，加10%（體積分數，下同）甲醇制成每1 mL含50 μg的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

2.4.3.1 飲片標準湯劑供試品溶液的制備取南瓜子飲片標準湯劑約0.5 g，精密稱定，加水20 mL 溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3.2 飲片供試品溶液的制備取南瓜子飲片（過3 號篩）約2.0 g，精密稱定，加水50 mL，水浴加熱回流30 min，取出，放冷，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系的考察 取苯丙氨酸對照品適量，精密稱定，加10%（體積分數，下同）甲醇制成質量濃度為0.42 mg/mL 的對照品儲備液。將儲備液逐級稀釋為每1 mL 含苯丙氨酸分別為12.5、50、100.0、200.0、400.0 μg 的對照品溶液，精密吸取上述5 種不同質量濃度的對照品溶液各10μL 注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項下條件分別進樣測定，以對照品的進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得苯丙氨酸回歸方程為Y=32.617X+2.227（r=0.999），在12.5～400 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.4.4.2 精密度試驗 取南瓜子飲片標準湯劑供試品溶液（S1），連續(xù)進樣6 次，按“2.4.1”項下方法測定。丙苯氨酸色譜峰峰面積的RSD%值為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3 重復性試驗 取南瓜子飲片標準湯劑供試品溶液（S1）6份，按“2.4.3.1”項下方法制備供試品溶液，計算質量分數。結果顯示，苯丙氨酸峰面積的平均質量分數RSD值為0.5%，表明方法重復性良好。

2.4.4.4 穩(wěn)定性試驗 取南瓜子飲片標準湯劑供試品溶液（S1），按“2.4.3.1 ”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、16、24 h 按照“2.4.1”項下方法進行測定。24 h內苯丙氨酸峰峰面積的RSD值為0.8%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗 分別精密稱取苯丙氨酸對照品1.123 mg、2.181 mg、3.362 mg置100 mL量瓶中，加水制成每1 mL 含苯丙氨酸0.011 2、0.021 8、0.033 6 mg的對照品溶液，備用。

取已知指標成分質量分數的南瓜子飲片標準湯劑（S1）0.25 g，共9 份，置具塞錐形瓶中，分3 組（低、中、高濃度）精密加入20 mL上述對照品溶液各3 份，按“2.4.3.1”項下方法制備9 份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率，結果苯丙氨酸平均回收率分別為94.4%、97.9%、100.5%，RSD值為3.6%，具體信息見表3。

表3 南瓜子飲片標準湯劑中苯丙氨酸加樣回收率試驗結果Table 3 Results of recovery of phenylalanine in standard decoction of pumpkin seeds（n=3）

2.4.4.6 南瓜子飲片標準湯劑質量分數的測定及轉移率的計算 取15 批南瓜子飲片及所制備的飲片標準湯劑，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，計算苯丙氨酸的質量分數。根據公式計算：轉移率=南瓜子飲片標準湯劑中苯丙氨酸質量分數×出膏率/南瓜子飲片中苯丙氨酸質量分數×100%。結果表明，15 批南瓜子飲片標準湯劑中苯丙氨酸平均質量分數為1.43 mg/g，苯丙氨酸質量分數范圍為0.56 ～1.99 mg/g，苯丙氨酸的轉移率均值為69.7%，苯丙氨酸轉移率范圍為42.7%～86.1%，結果見表4。

表4 南瓜子飲片標準湯劑中苯丙氨酸的質量分數及轉移率Table 4 Content and transfer rate of phenylalanine in stan‐dard decoction of pumpkin seed slices

2.5 特征圖譜的建立

2.5.1 色譜條件 同“2.4.1”項下。

2.5.2 對照品溶液的制備 分別取苯丙氨酸、酪氨酸對照品適量，精密稱定，加10%甲醇分別制成每1 mL含苯丙氨酸、酪氨酸50 μg的對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 同“2.4.3”項下。

2.5.4 方法學考察

2.5.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取陰性對照溶液（水）、“2.5.2 ”項下對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按“2.5.1”項下方法測定，結果表明陰性對照無干擾，方法專屬性良好。

2.5.4.2 精密度試驗 取南瓜子飲片標準湯劑（S1）供試品溶液，連續(xù)進樣6次測定，結果各特征峰的相對保留時間RSD 值均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.3 重復性試驗 取南瓜子飲片標準湯劑（S1），平行制備6 份供試品溶液進樣測定，結果各特征峰的相對保留時間RSD 值均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.5.4.4 穩(wěn)定性試驗 取南瓜子飲片標準湯劑供試品溶液（S1），于配制后第0、4、8、12、16、24小時進樣測定，記錄各共有峰的保留時間。結果表明各共有峰與參照峰的相對保留時間RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.5 共有峰的標定及共有模式的建立 取15 批南瓜子飲片及飲片標準湯劑，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，將各色譜峰匹配，建立的特征圖譜呈現13個共有特征峰，15批樣品特征圖譜相似度均大于0.9，13 個峰占色譜峰總面積的95%以上，提示該方法可用于南瓜子藥材質量的整體評價。通過對照品指認了2 個特征峰，其中峰3 為酪氨酸，峰7為苯丙氨酸。將苯丙氨酸峰標為S峰，計算特征峰峰1、2、4、5、6、8、9、10、11、12、13 與S 峰的相對保留時間，分別為0.27（峰1）、0.37（峰2）、0.53（峰4）、0.60（峰5）、0.71（峰6）、1.10（峰8）、1.28（峰9）、1.40（峰10）、1.85（峰11）、2.23（峰12）、2.32（峰13）。見圖3－5、表5。

圖3 南瓜子飲片標準湯劑的HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatograms of pumpkin seed slices stan‐dard decoc

圖4 15批南瓜子飲片標準湯劑的HPLC疊加圖譜Figure 4 HPLC overlay chromatograms of 15 batches of pumpkin seed slices standard decoction

圖5 15批南瓜子飲片的HPLC疊加圖譜Figure 5 HPLC overlay chromatograms of 15 batches of pumpkin seeds decoction pieces

表5 15 批南瓜子飲片及飲片標準湯劑相似度Table 5 Similarity of 15 batches of pumpkin seed slices and standard decoction

3 討論

3.1 色譜條件及供試品溶液制備方法的選擇

本研究考察了不同品牌的色譜柱、不同有機相體系（甲醇、乙腈）、不同流動相（0.1%磷酸、0.1%醋酸、0.1%甲酸、水）、不同柱溫（23、25、30 ℃）、不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、不同品牌儀器（Waters e2695、Agilent 1260 和UltiMate 3000）的分離效果，結果特征圖譜以檢測波長210 nm、甲醇-水為流動相；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min 時分離效果較好。同時考察了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇）的提取效果，結果以水提取時效果最好。

3.2 南瓜子飲片標準湯劑的質量控制

3.2.1 原料的選擇 本研究基于歷史古籍的本草考證及產地實際考察，確定了在古籍中記載的基原性狀判斷與《衛(wèi)生部藥品標準維藥分冊》[12]中的基原相同，為葫蘆科植物南瓜的干燥成熟種子。15 批南瓜子藥材來自不同的主產區(qū)，所選樣品在產地、質量水平等方面均具有代表性。

3.2.2 出膏率的研究 根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，按照中藥調劑“逢殼必搗，逢籽必破”等傳統經驗對飲片進行預處理[24]，并對南瓜子的破碎粒度進行考察。最終選擇破殼率應不低于90%。本研究結合標準湯劑的制備工藝要求，加水量以浸過藥面2～5 cm 為宜，對其加水量及煎煮時間進行考察，研究顯示加水量對出膏率影響不大，隨著煎煮時間的增加，出膏率會有所增減，但相差不大，因此出于節(jié)約資源、同時為后續(xù)濃縮工序節(jié)約時間的考慮，確定標準湯劑制備工藝為一煎加8 倍水，煎煮30 min；二煎加6 倍水，煎煮25 min[19?20]。15 批南瓜子飲片制備成南瓜子飲片標準湯劑的出膏率在10.4%～18.3%之間，各批次間出膏率差異不大，說明標準湯劑制備工藝穩(wěn)定可行。

3.2.3 質量分數測定的研究 建立氨基酸質量分數測定方法時對供試品制備方法進行了考察，并開展了方法學的驗證（專屬性、線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性），結果表明方法專屬性強、重復性好，符合質量分數測定的要求。通過測定轉移率及出膏率重點考察標準湯劑制備工藝的穩(wěn)定性，通過質量分數測定考察不同批次標準湯劑質量的均一性。結果南瓜子15 批次標準湯劑中苯丙氨酸質量分數為0.56 ～1.99 mg/g，轉移率范圍為42.7%～86.1%，表明各批次南瓜子中苯丙氨酸質量分數稍有差異，應與產地、批次差異性有關。

3.2.4 定性鑒別的研究 根據文獻報道，南瓜子的主要化學成分為氨基酸、脂肪酸等[17?19]。由于南瓜子飲片標準湯劑為經水煮后提取的物質，應綜合考慮化學成分的水溶性特點及化學成分的質量分數，質量分數較低或脂溶性的物質可能無法在水溶后進行呈現。在南瓜子的以上成分中，氨基酸成分質量分數較高且水溶性較好，故將其作為南瓜子飲片標準湯劑特征圖譜的主要化學成分。

在特征圖譜研究中，根據多批南瓜子飲片及飲片標準湯劑的測定結果，確立了南瓜子飲片及飲片標準湯劑供試品色譜的13 個特征峰，并指認苯丙氨酸與酪氨酸2 種成分。經“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）軟件”計算，各批次南瓜子飲片以及飲片標準湯劑特征圖譜的相似度均大于0.9，說明南瓜子飲片標準湯劑的化學組分共性較好，方法學考察符合要求，本方法穩(wěn)定可行、重復性良好。

4 結語

本研究收集并制備了15 批不同產地的南瓜子飲片標準湯劑，建立以丙氨酸為對照的南瓜子氨基酸成分TLC 鑒別法；采用苯丙氨酸為指標成分進行質量分數測定，計算了15 批樣品的轉移率和出膏率；同時建立南瓜子飲片標準湯劑的特征圖譜檢測方法，利用對照品指認出其中2 個特征峰。本研究所建立的方法具有良好的可行性與準確性，能較全面反映南瓜子飲片標準湯劑的內在質量，可為南瓜子飲片質量控制提供參考，為南瓜子飲片標準湯劑的制備及質量研究提供基礎，同時為南瓜子飲片新劑型的開發(fā)、使用劑量統一以及質量監(jiān)測奠定基礎。