楮實子含藥血清對成骨細胞功能的影響

顏志鵬，杜小康，楊鴻遒，溫志剛，余騰燁，劉云，陳珺，2

（1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學生物資源與創(chuàng)新藥物研究中心，廣東 廣州 510006）

成骨細胞是主導骨形成的功能細胞，在骨骼發(fā)育、重塑和再生過程中發(fā)揮著重要的作用[1]，其數(shù)量與功能的變化與代謝性骨?。ㄈ绻琴|疏松癥）的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關，是進行藥物篩選和研發(fā)的主要靶細胞之一。楮實子（Fructus Broussonetiae,FB）收載于《中國藥典》（2020 年版）一部，為桑科植物構樹的干燥成熟果實，具有補腎清肝、明目利尿等作用，常用于腰膝酸軟、虛勞骨蒸等病癥[2]。歷代醫(yī)家認為其“味甘，性寒，無毒”，《名醫(yī)別錄》載楮實功用大補益，《日華子本草》云楮實壯筋骨[3]。現(xiàn)代藥理學研究表明其可抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]，具有治療阿爾茲海默癥、肝硬化、腹腔積液等的潛力[7?8]，但尚未見楮實子影響成骨細胞功能的文獻報道。楮實子中含有楮實子油、氨基酸、黃酮類化合物、生物堿、皂苷類和多糖等成分[9]，其中黃酮類化合物包括紅色素、芹菜素、槲皮素等[10]，研究表明黃酮類化合物多具有抗成骨細胞凋亡[11]和促進成骨細胞增殖、分化礦化[12?15]等生物活性，因此推測，楮實子提取物可能對成骨細胞功能產(chǎn)生積極影響。

本實驗采用血清藥理學方法，將楮實子水煎劑灌胃大鼠后分取血清，作用于原代培養(yǎng)的大鼠成骨細胞，觀察含藥血清對成骨細胞增殖、分化及其功能的影響，為楮實子在代謝性骨病防治中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與實驗動物

1.1.1 實驗動物 3 月齡SPF 級雌性SD 大鼠16 只，體質量（300 ± 20）g，購自廣東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002；SD 大鼠乳鼠（＜24 h），購自珠海百事通生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0051。實驗經(jīng)廣東藥科大學實驗動物中心倫理審查，批準號gdpu‐lacspf2017477。

1.1.2 試劑 楮實子（康美藥業(yè)股份有限公司，批號：200604531），由廣東藥科大學中藥學院馬鴻雁副教授鑒定為正品；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號：8122595）；胎牛血清（Gibco 公司，批號：42F1394K）；EDTA（Sigma 公司，批號：BCBV2141）；β-甘油磷酸鈉（Sigma 公司，批號：BCCC6949）；地塞米松（Sigma公司，批號：D1756）；維生素C（Sigma公司，批號：SLBN3883V）；I 型膠原酶（Sigma 公司，批號：17100-017）；MTT（噻唑藍，Amresco 公司，批號：475989）；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A059-2-2）；水合氯醛（麥克林，批號：C12195151）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：121820210409）；茜素紅S（北京索萊寶公司，批號：20160127）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海貝博科技有限公司，批號：062122220804）；RIPA 裂解液（強）（上海碧云天生物技術有限公司，批號：061721210930）；β-actin鼠單克隆抗體（Abcam公司，批號：ab8226）；OSX 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號：ab209484）；Coll-I 鼠單克隆抗體（Abcam 公司，批號：ab6308）；ALP 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號：ab95462）；OPN 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號：ab8448）；OPG 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號：ab73400）；辣根過氧化氫酶標記二抗鼠抗（Abcam公司，批號：ab6789）；辣根過氧化氫酶標記二抗兔抗（Abcam公司，批號：ab6721）。

1.1.3 主要儀器 SW-CT 系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Galaxy S+系列二氧化碳培養(yǎng)箱（New Brunswick Scientific 公司）；TDZ5-WS 臺式多管低速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；J-D200 倒置生物顯微鏡（深圳拓天儀器設備有限公司）；沃特浦wp-up-uv-20 型實驗室專用超純水機（四川沃特爾水處理有限公司）；Sorvall ST 16R 型4 ℃高速離心機（Thermo fisher Scientific 公司）；PowerPac HC電泳儀（Bio-Rad公司）；Tanon 4100 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Microplate Reader 680 酶標儀（Bio-Rad公司）等。

1.2 含藥血清制備與含藥（空白）培養(yǎng)基配制

含藥血清的制備：取10 g 楮實子與100 mL 蒸餾水混合，浸泡1 h 后煎煮1.5 h，濾出藥液，過濾后的藥渣再加100 mL 蒸餾水煎煮1.5 h，合并2 次濾液，濃縮制成終質量濃度為200 mg/mL 的楮實子水煎劑。SD 大鼠隨機分為空白對照組（8 只）和藥物組（8 只），分別灌胃生理鹽水（5 mL/kg）和楮實子水煎劑（生藥含量1 g/kg），連續(xù)灌胃10 d，劑量按臨床用量換算；末次給藥前大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，5%（φ）水合氯醛麻醉大鼠后，進行心臟穿刺采血并分離血清，每組血清混勻、過濾除菌后分裝，置于?80 ℃冰箱備用。實驗時將空白血清及含藥血清用無血清成骨誘導培養(yǎng)基（含終濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10?8mol/L 地塞米松和50 mg/L 維生素C 的DMEM 高糖培養(yǎng)基）配成終濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)基。

1.3 成骨細胞分離培養(yǎng)

新生乳鼠處死后置于75%（φ）酒精中浸泡消毒10 min，無菌操作分取顱骨置于含磷酸緩沖溶液（PBS）的培養(yǎng)皿中，清除骨膜、血管和結締組織后剪成1 mm3大小的骨片，加入胰酶-EDTA 溶液消化15 min（37 ℃），棄去消化液后加入I 型膠原酶消化1 h（37 ℃），3 000 r/min 離心5 min，棄上清，再次加入I 型膠原酶37 ℃消化1 h（37 ℃），離心并棄上清后加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細胞并轉移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%融合時以酶消化法傳代培養(yǎng)，從P2代細胞開始使用成骨誘導培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10?8mol/L地塞米松和50 mg/L 維生素C）培養(yǎng)。取P3-P5 代成骨細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 成骨細胞鑒定

取P3 代成骨細胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，95%乙醇固定細胞后根據(jù)AKP 染液試劑盒使用說明書進行染色并在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 成骨細胞增殖率檢測

成骨細胞以1×104個/mL 的細胞密度接種于96孔板，設5%、10%、20%空白血清對照組，5%、10%、20%含藥血清組，每組6復孔。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基并加入MTT 試劑100 μL，37 ℃孵育4 h 后去除上清液，加入100 μL DMSO 溶液，在酶標儀570 nm波長處測定吸光度（A）值。分別以同濃度空白血清組為對照計算同濃度含藥血清組成骨細胞的相對存活率；以5%空白血清組為對照組計算10%和20%空白血清組成骨細胞的相對存活率；以5%含藥血清組為對照組計算10%和20%含藥血清組成骨細胞的相對存活率。

1.6 成骨細胞AKP活性和礦化結節(jié)檢測

成骨細胞以2×104個/mL 的細胞密度接種于24孔板，設10%空白血清對照組和10% 含藥血清組，每組5復孔。培養(yǎng)72 h后，吸取適量上清液，按AKP試劑盒說明書操作，在酶標儀450 nm 波長處測定吸光度（A）值。連續(xù)培養(yǎng)21 d后，以茜素紅染液染色，觀察礦化結節(jié)的數(shù)量、體積與著色，并通過BIOQUANT OSTEO 自動圖像分析軟件計數(shù)各組細胞20倍鏡下5個視野的礦化結節(jié)數(shù)量。

1.7 成骨細胞蛋白提取與成骨功能指標相關基因的蛋白表達測定

成骨細胞以5×108個/mL 的細胞密度接種于10 cm×10 cm 培養(yǎng)皿，分組處理同“1.6”。培養(yǎng)48 h后，加入RIPA 蛋白抽提試劑提取總蛋白，按BCA 蛋白質定量試劑盒說明書操作，在酶標儀562 nm 波長處測定吸光度（A）值，并根據(jù)標準曲線計算各組蛋白濃度。各組取等量蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳后轉膜1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），再以含5%脫脂奶粉的TBST 溶液進行封閉處理，封閉完成的膜經(jīng)TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入一抗（1∶3 000），置于4 ℃搖床輕搖過夜，第2 天室溫孵育1 h并經(jīng)TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入二抗（1∶5 000），4 ℃搖床輕搖1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），經(jīng)曝光、顯影、定影后，以Uvipro凝膠成像系統(tǒng)掃描并采用Image J 軟件測量各蛋白條帶吸光度值，以目的蛋白和內參蛋白的吸光度比值表示目的蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 對實驗結果進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞的鑒定

原代成骨細胞培養(yǎng)12～24 h 后開始伸展貼壁，48～72 h 貼壁完全；經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞呈飽滿的多角形或梭形，連續(xù)培養(yǎng)7 d 后，細胞大多呈多角立方形，細胞中央可見輪廓清晰的圓形或卵圓形細胞核，經(jīng)AKP染色后細胞呈藍紫色（如圖1）。

圖1 成骨細胞堿性磷酸酶染色鑒定Figure 1 Identification of osteoblasts by alkaline phosphatase staining（40×）

2.2 楮實子對成骨細胞增殖率的影響

成骨細胞增殖率測定結果如表1 所示，楮實子各濃度含藥血清實驗組所測得A 值均高于空白血清對照組，說明楮實子含藥血清可顯著促進成骨細胞增殖（P＜0.01）；不同濃度空白血清組組間差異無統(tǒng)計學意義；與5%含藥血清組相比，10%和20%含藥血清組成骨細胞增殖率明顯提高（P＜0.05），但10%和20%含藥血清組組間差異無統(tǒng)計學意義，結合文獻[16]，選擇10%含藥血清濃度進行后續(xù)實驗。

表1 成骨細胞增殖率測定結果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

表1 成骨細胞增殖率測定結果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

注：1.與同濃度空白血清組比較計算相對增殖率，與同濃度空白血清組比較：**P＜0.01；2.與5%空白血清組比較計算相對增殖率；3.與5%含藥血清組比較計算相對增殖率，與5%含藥血清組比較：#P＜0.05。

?

2.3 楮實子對成骨細胞AKP 活性和礦化結節(jié)形成的影響

成骨細胞AKP 活性檢測結果如表2 所示，10%含藥血清組成骨細胞的AKP 活力明顯高于10%空白血清組（P＜0.01），說明楮實子含藥血清能顯著促進成骨細胞分化。成骨細胞礦化結節(jié)茜素紅染色結果如圖2 所示，計數(shù)結果如表2 所示。與10%空白血清組相比，10%含藥血清組成骨細胞礦化結節(jié)體積明顯增大，數(shù)量明顯增加（P＜0.01），說明楮實子含藥血清可以促進成骨細胞礦化結節(jié)的形成。

表2 成骨細胞AKP活力測定結果與礦化結節(jié)計數(shù)結果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

表2 成骨細胞AKP活力測定結果與礦化結節(jié)計數(shù)結果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

與同濃度10%空白血清組比較：**P＜0.01。

?

圖2 成骨細胞礦化結節(jié)染色結果（A圖：1×，B圖：20×）Figure 2 Staining results of mineralized nodules in osteoblasts

2.4 成骨細胞功能指標基因表達檢測結果

Western blot 結果如圖3 所示，10%含藥血清組成骨細胞上OSX、Coll-I、ALP、OPN 和OPG 的蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），說明楮實子對成骨細胞的骨形成有積極作用。

圖3 成骨功能指標基因的蛋白表達Figure 3 Expression of osteogenic function indicator proteins(,n=3)

3 討論

楮實子是桑科植物構樹的干燥成熟果實，收載于《中國藥典》（2020 年版）一部，常用于肝腎不足、腰膝酸軟、虛勞骨蒸等病癥[2]，古籍載其功用大補益、能壯筋骨等[3]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)楮實子對小鼠多種實體瘤均有抑制作用，并能顯著清除羥基自由基，具有較強的體外抗氧化作用[4?5]；楮實子也具有抗皮膚光老化的能力[6]，并能抑制Aβ沉積、改善學習記憶能力[8]，但目前尚未見楮實子調節(jié)骨代謝、影響成骨細胞功能的文獻報道。

劉宏偉等[9?10]對楮實子的化學成分進行提取并分析，發(fā)現(xiàn)楮實子中含有多種黃酮類化合物，如紅色素、芹菜素、槲皮素及淫羊藿等。另有研究認為黃酮類化合物多具有促進成骨細胞增殖、分化礦化的能力[17]，如槲皮素能恢復經(jīng)甲基乙二醛處理后的成骨細胞的GSK-3β磷酸化以及Nrf2 蛋白表達水平并能抑制該成骨細胞凋亡[11]；淫羊藿苷則能促進前成骨細胞增殖，并通過激活BMP 等信號通路來促進成骨細胞增殖、分化和基質鈣化[12?15]。因此推測，楮實子提取物可能對成骨細胞功能產(chǎn)生積極影響。

血清藥理學是指中藥或中藥復方按一定劑量給動物灌胃一定時間后，采集動物的血液并分離血清，以含藥血清作為藥物直接加入離體反應系統(tǒng)中來研究藥理機制的一種半體內實驗方法[18]。中藥所含化學成分在生物體內環(huán)境下會發(fā)生復雜的代謝或生物轉化，即中藥煎煮后得到的化合物可能只是活性成分的前體，且將中藥直接作用于細胞可能會出現(xiàn)較大的毒性反應[19]，采用血清藥理學方法進行研究則能通過體外實驗觀察中藥的藥理效應[20]。在血清藥理學研究中，含藥血清的制備需要考慮供體動物種屬的選擇，供體動物是否需要造模，以及藥物的給藥方式、時間及采血時間等問題[21]。本實驗中，制備含藥血清的動物與提取原代成骨細胞的動物種屬一致，可以有效避免實驗受到因種屬差異帶來的免疫源性等不利影響[22]；參照楮實子的臨床給藥劑量（6～12 g/d）[2]，按《中藥藥理研究方法學》中人與大鼠體表面積系數(shù)法計算大鼠實驗劑量為0.9 ～1.8 g/kg[23]，本實驗中以1 g/kg 劑量連續(xù)灌胃給藥10 d，以確保含藥血清濃度達到穩(wěn)定[24]。

MTT 實驗結果表明，與同濃度空白血清組相比，楮實子含藥血清在5%、10%和20%濃度時均可顯著促進成骨細胞增殖，但各濃度空白血清組組間無顯著性差異；扣除空白血清的影響后，10%和20%楮實子含藥血清組成骨細胞的增殖率明顯高于5%含藥血清組，但10%和20%楮實子含藥血清組組間無明顯差異，因此，選擇10%濃度的含藥血清進行后續(xù)實驗，這也與血清藥理學研究中公認的血清添加濃度一致[16]。

骨形成過程中成骨細胞會經(jīng)歷細胞增殖、細胞外基質形成與成熟和基質礦化3 個時期，期間將產(chǎn)生細胞外基質蛋白和基質礦化調節(jié)因子等多種生物活性物質，并最終分化為成熟的骨細胞[25]。成骨細胞AKP活性能反映其分化能力，礦化結節(jié)數(shù)量則能反映其礦化功能，本研究結果表明楮實子含藥血清能顯著提高成骨細胞的AKP 活性和礦化結節(jié)數(shù)量，說明楮實子能促進成骨細胞的分化和礦化。OSX、ALP、OPN 等蛋白是成骨細胞分化、礦化進程中的標志性蛋白，檢測其變化能反映成骨細胞的分化、礦化進程和成骨功能[26?27]。本研究結果表明楮實子含藥血清能顯著上調OSX、Coll-I、ALP、OPN和OPG 等成骨功能標志蛋白的表達水平，說明楮實子對成骨細胞的骨形成有積極作用。

綜上所述，楮實子能促進成骨細胞增殖、分化和礦化，并通過上調成骨調節(jié)因子促進成骨細胞及細胞基質的成熟，進而增強成骨功能，但具體分子機制還有待后續(xù)研究深入探討。本研究結果表明楮實子具有防治代謝性骨病的潛力，為后續(xù)進一步明確楮實子的骨保護作用提供了實驗依據(jù)。