丙酮鹽酸混合液提取土壤腐殖質(zhì)組分的光譜學(xué)特征

宋 鴿, 孔祥仕

1. 黑龍江大學(xué)中俄學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150080 2. Institute of Earth Sciences, St. Petersburg State University, St. Petersburg 199034, Russia 3. 吉首大學(xué)旅游學(xué)院, 湖南 吉首 416000

引 言

腐殖質(zhì)(humic substances, HS)是動植物殘余物經(jīng)化學(xué)、 生物轉(zhuǎn)化, 以及微生物代謝等形成的天然高分子化合物, 是地球表面主要有機(jī)碳庫[1]。 在腐殖化過程中, 原本結(jié)構(gòu)明確的四大類生物分子單體(蛋白質(zhì)、 多糖、 脂質(zhì)和木質(zhì)素)經(jīng)縮合, 轉(zhuǎn)化為功能相似但結(jié)構(gòu)各異的HS, 形成的HS并不是前體生物分子單體間的簡單加和, 而是形成了具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)屬性的一系列高分子化合物或混合物[2]。 HS呈棕褐色、 無定形、 具有親水性、 多分散性和酸性, 因此IHSS建議采用混合堿液(NaOH+Na4P2O7)提取法獲取HS, 事實(shí)上此種方法提取費(fèi)時(shí)、 提取率低。 土壤HS包括胡敏酸(HA)、 富里酸(FA)和胡敏素(HU)。 HA和FA統(tǒng)稱為腐殖酸, 是HS中的活性部分[3], 其化學(xué)組成中羧基和羥基等含氧官能團(tuán)的存在能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育。 HU與無機(jī)礦物緊密結(jié)合, 在任何pH水溶液中都不溶解, 在維持土壤結(jié)構(gòu)、 保持土壤養(yǎng)分和調(diào)節(jié)土壤營養(yǎng)元素循環(huán)等方面具有重要作用。

不同的提取方法獲取HS組分在化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)上存在差異。 近年來, 眾多學(xué)者通常采用IHSS(國際腐殖質(zhì)協(xié)會)推薦的混合堿液提取法, 比較不同來源HS化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)差異, 研究HS化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)某些“重要結(jié)構(gòu)原件”與其生理活性的相關(guān)性。 由于傳統(tǒng)的堿液提取法對土壤HS提取不夠充分, 堿液能夠水解土壤有機(jī)質(zhì)并破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu), 現(xiàn)今的研究技術(shù)和手段無法明確HS化學(xué)結(jié)構(gòu)等, 因此已有的研究成果僅停留在理論假設(shè)階段。 目前土壤HS研究更多的關(guān)注不同外界因素影響下HS組分含量的變化, 對于在不同土地利用方式下HS化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征變化規(guī)律的研究較少。 本文首次采用丙酮鹽酸混合液, 從開墾和未開墾土壤樣品中提取HA和HU, 利用元素分析、 紫外-可見漫反射光譜和近紅外光譜等手段研究HS化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)特征, 比較開墾和未開墾不同類型土壤HA和HU化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征的變化, 力爭為HS生物化學(xué)和生理活性的研究提供新的技術(shù)手段, 為合理利用土壤資源提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 土壤樣品

土壤樣品采自俄羅斯西南部貝爾戈羅德地區(qū), 該地區(qū)的特點(diǎn)是溫帶大陸性氣候, 夏季炎熱干燥, 冬季寒冷。 年平均氣溫+6 ℃, 1月平均氣溫-8.1 ℃, 7月平均氣溫+19.9 ℃。 本研究所選土壤樣品分別為未開墾黑土(10～20 cm, AU1; 20～40 cm, AU2)、 開墾黑土(10～20 cm, PU1; 20～40 cm, PU2)、 未開墾灰土(0～18 cm, AY; 18～37 cm, AEL)、 開墾灰土(0～15 cm, PY1; 15～30 cm, PY2)。 各樣地采用五點(diǎn)取樣法收集土樣, 風(fēng)干去除草根、 砂粒等, 研磨過2 mm篩備用。

1.2 HS組分提取及純化

稱取100 g過篩風(fēng)干土樣, 溶于1 L丙酮鹽酸(90%丙酮∶HCl=9∶1,m∶m)混合溶液, 靜置過夜, 3 000～4 000 r離心30 min, 過濾收集濾液, 濾液用去離子水稀釋2倍, 靜置過夜后, 3 000～4 000 r離心 30 min, 收集沉淀, 保留上清液。 沉淀用0.02 mol·L-1NaOH溶液溶解, 過陽離子交換樹脂進(jìn)行純化, 洗脫液冷凍干燥得到HA干物質(zhì)。 將保留上清液用0.1 mol·L-1NaOH溶液滴定至pH 7, 獲得HU沉淀, 棄掉上清液, 沉淀多次用去離子水洗滌, 直至AgNO3溶液滴定上清液檢測不到Cl-, 將沉淀冷凍干燥, 獲取HU干物質(zhì)備用。

1.3 元素分析

分別稱取冷凍干燥HA和HU樣品約2 mg于德國Elementar公司生產(chǎn)的Vario Microcube元素分析儀上測定C、 H、 N和S元素含量, 其中O元素含量采用差減法計(jì)算。

1.4 紫外-可見漫反射光譜

采用紫外-可見漫反射光譜僅對HA和HU固體粉末進(jìn)行掃描, 波長范圍200～800 nm。 在254 nm處測定吸光度, 記為SUVA254。 在465和665 nm處分別測定吸光度, 記為E4和E6, 并計(jì)算E4/E6值[4]。

1.5 近紅外光譜分析

分別稱取2 mg冷凍干燥HA和HU樣品與100 mg KBr混合, 充分研磨后壓片并放入紅外干燥箱中干燥以除去樣品中水分子的影響。 采用Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker, 德國)進(jìn)行紅外光譜分析, 測定參數(shù)為: 分辨率4 cm-1; 測定范圍: 4 000～400 cm-1。 對譜線選取特征峰, 并對相應(yīng)的官能團(tuán)進(jìn)行半定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

紫外-可見漫反射光譜和近紅外光譜數(shù)據(jù)采用OriginPro8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 HS元素分析

表1 HA各種元素含量和原子比

表2 HU各種元素含量和原子比

比較開墾和未開墾土壤的不同土層中提取HA的元素組成, AY的C和H元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最大, O/C比值最小, 說明縮合度最小, 分子結(jié)構(gòu)最簡單, 氧化度最小, 羧酸等含氧官能團(tuán)含量最少, 而C/N比值最大, 腐殖化程度最低, 穩(wěn)定性最小, 而(N+O)/C比值最小, 極性最小。 PU2的C和N元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 說明羧酸等含氧官能團(tuán)含量、 氧化度和極性最大(表1)。 對于開墾和未開墾土壤的不同土層中提取HU的元素組成, AY的C、 H、 N和S元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最小, 說明縮合度最大, 結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜, 而PY1的C、 H和S元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 說明氧化度、 羧酸等含氧官能團(tuán)含量和極性最大(表2)。 比較開墾因素對黑土和灰土HA和HU各種元素含量和原子比的影響, 可知開墾因素對黑土HA和HU元素組成和原子比影響相對較小, 而開墾因素明顯增加了灰土HA和HU中O元素和含氧官能團(tuán)的含量、 氧化度和極性, 原因可能是黑土成土條件和過程相對復(fù)雜, 外界擾動因素對其影響相對較小, 而開墾因素促進(jìn)灰土土壤有機(jī)質(zhì)的分解, 復(fù)雜的有機(jī)大分子結(jié)構(gòu)氧化分解轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬唵蔚男》肿咏Y(jié)構(gòu)。

2.2 HS紫外-可見漫反射光譜

開墾和未開墾土壤的不同土層中HA和HU紫外-可見漫反射光譜形狀相似, 吸光度值隨著波長的增加呈下降趨勢。 由于HS的組成復(fù)雜, 多種官能團(tuán)互相干擾, HA和HU紫外-可見漫反射光譜無明顯特征峰, 吸光度值大表明其包含的吸光基團(tuán)較多。 PY2的HA吸光度值最大, AU1吸光度值最小, 表明PY2包含的吸光有機(jī)成分最多, AU1包含的吸光有機(jī)成分最少(圖1)。 AY的HU吸光度值最大, 其余研究對象的吸光度相對較小, 說明AY包含的吸光有機(jī)成分最多(圖2)。 各研究對象HA吸光度值大于HU吸光度值, 說明HA包含的吸光有機(jī)成分較多, 化學(xué)組成較為復(fù)雜。

圖2 HU紫外-可見漫反射光譜

紫外特征參數(shù)SUVA254常被用來表征HS的芳香性[8]。 比較HA和HU的SUVA254可知(表3和表4), HA芳香性大于HU, 即HA包含更多的芳香結(jié)構(gòu), 與元素分析中原子比C/H分析結(jié)果完全相符。 此外,E4/E6與HS的芳香度和芳香碳鏈的縮合程度有關(guān), 可以作為腐殖化程度的指標(biāo)[9]。E4/E6值越大, 芳香族組分的縮合度越小, 分子結(jié)構(gòu)越簡單, 分子量越小[10], 腐殖化程度越低。 事實(shí)上E4/E6值與分子量相關(guān)性的研究還存在爭議[11]。 比較HA和HU的E4/E6可知(表3和表4), HU芳香族組分的縮合度較小, 分子結(jié)構(gòu)較為簡單且腐殖化程度低, 這與元素分析的結(jié)果基本一致。 將開墾和未開墾土壤某一土層中HA和HU紫外特征參數(shù)與元素分析原子比計(jì)算結(jié)果進(jìn)行對比分析, 二者結(jié)論不完全相符, 由于HS超分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)組成的復(fù)雜性, 對于相同來源同一HS組分結(jié)構(gòu)的全面表征還需要多種技術(shù)手段聯(lián)用。

表3 HA紫外特征參數(shù)

表4 HU紫外特征參數(shù)

2.3 HS紅外光譜

圖3 HA紅外光譜

圖4 HU紅外光譜

表5 HA紅外光譜主要吸收峰的相對強(qiáng)度/cm-1(半定量)

表6 HU紅外光譜主要吸收峰的相對強(qiáng)度/cm-1(半定量)

3 結(jié) 論

HA是土壤有機(jī)質(zhì)中的活性組分, 而HU是土壤有機(jī)質(zhì)中的惰性組分, 與礦物質(zhì)緊密結(jié)合具有堿不溶性和大分子結(jié)構(gòu)的特性, 呈現(xiàn)不均一性。 本研究采用丙酮和鹽酸混合液從土壤樣品中分離提取HA和HU組分, 為HS生物化學(xué)和生理活性的研究提供了新的技術(shù)手段。 采用元素分析和光譜學(xué)等對HA和HU進(jìn)行元素分析和光譜學(xué)特征研究, 結(jié)果表明, HA和HU具有相似的元素和官能團(tuán)組成, HA和HU的元素組成以C和O元素為主, 原子比分析表明, HA的結(jié)構(gòu)以芳香族結(jié)構(gòu)為主, 而HU的結(jié)構(gòu)以脂肪族結(jié)構(gòu)為主。 HA和HU紫外-可見漫反射光譜形狀相似, 無明顯特征吸收峰, 吸光度隨著波長的增加呈下降趨勢。 與HU相比, HA包含的吸光有機(jī)成分較多, 化學(xué)組成較為復(fù)雜。 此外, HA和HU的紫外特征參數(shù)SUV254和E4/E6與元素分析中原子比分析結(jié)果基本相符, 而對于相同HS組分某一土層中HA和HU的分析不完全相符, 需要多種光譜學(xué)手段聯(lián)用全面表征HS結(jié)構(gòu)特征。 HA和HU具有相似的紅外光譜圖, 各主要特征吸收峰的吸收強(qiáng)度不同。 開墾黑土20～40 cm(PU2)和未開墾灰土18～37 cm(AEL)的HA在各特征吸收峰的振動幅度均最大, 表明兩者所包含的酚類化合物、 含羥基化合物、 脂肪族化合物、 羧酸、 以及含羰基的醛、 酮和醚等化合物含量最多, 而未開墾灰土18～37 cm(AEL)和開墾黑土10～20 mm(PU1)的HU在各特征吸收峰振動幅度最大, 說明其包含的酚類化合物、 羧酸、 脂肪族和糖類化合物含量較多。

不同的土地利用方式下, 由于管理措施、 凋落物量和質(zhì)量差異的影響, 可能導(dǎo)致土壤HS結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等方面發(fā)生改變。 由紅外光譜分析可知, 開墾對黑土和灰土的影響不同, 開墾后黑土HA和HU酚類化合物、 羥基官能團(tuán)和脂肪族化合物等含量增加, 而開墾后灰土HA和HU酚類化合物、 羧基和脂肪族化合物含量下降, 原因可能是黑土成土條件和過程相對復(fù)雜, 外界擾動因素對土壤有機(jī)質(zhì)影響相對較小, 外界開墾因素在一定程度上增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量, 而開墾因素促進(jìn)灰土土壤有機(jī)質(zhì)的分解, 這與元素分析的結(jié)果基本相符。

丙酮鹽酸混合液提取法為HS生物化學(xué)和生理活性的研究提供了新的技術(shù)手段, 為合理利用土壤資源提供理論依據(jù)。