傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對金銀花中有效成分定量模型建立及含量測定

顧旭鵬, 楊林林*, 齊大明, 劉天亮, 董誠明*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 河南 鄭州 450046 2. 河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心, 河南 鄭州 450046

引 言

中藥材金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos)來源于忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花, 現(xiàn)代研究表明, 其在清熱解毒、 抗菌抗病毒、 抗氧化、 保肝、 調(diào)節(jié)免疫等方面具有良好的療效[1]。 近些年, 特別是新冠疫情以來, 中成藥蓮花清瘟膠囊、 透解祛瘟顆粒(肺炎1號方)、 雙黃連口服液等, 以及江西省、 河北省、 廣東省、 湖北省、 天津市等發(fā)布的中醫(yī)藥新冠肺炎防治處方, 均含有金銀花[2]。 促使了近些年金銀花需求量及經(jīng)濟(jì)價值不斷攀升, 種植面積也逐年增加, 導(dǎo)致了假冒偽劣問題愈發(fā)嚴(yán)重[3], 多見不同產(chǎn)地、 不同批次的金銀花藥材出現(xiàn)質(zhì)量波動大、 品質(zhì)優(yōu)劣不一的現(xiàn)象。 因此尋找一種高效、 便捷的含量檢測方法已迫在眉睫。

在傳統(tǒng)模式下, 金銀花有效成分含量測定主要以《中國藥典》為參照, 2020年版中國藥典以綠原酸、 異綠原酸A、 異綠原酸C、 木犀草苷作為金銀花質(zhì)量控制的主要指標(biāo), 且各個指標(biāo)成分的含量測定都以HPLC法為主, 但該方法的樣品前處理復(fù)雜, 樣品損壞, 耗時費力, 有諸多影響因素, 更不適合大批量樣品的含量測定[4]。 傅里葉紅外光譜分析技術(shù)有著HPLC法所不具有的掃描速度快、 操作簡便、 分析過程快速無損、 不需要樣品預(yù)處理、 應(yīng)用廣泛等優(yōu)點[5]。 因此, 以傅里葉紅外光譜分析技術(shù)實現(xiàn)金銀花有效成分的含量測定是一種更優(yōu)的選擇。

近些年紅外光譜技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于中藥質(zhì)量評估、 中藥真?zhèn)舞b定、 中藥近緣種鑒定、 野生與栽培鑒別等[6], 鮮有使用紅外光譜技術(shù)實現(xiàn)金銀花有效成分含量測定的研究。 本研究通過使用傅里葉變換紅外光譜技術(shù), 根據(jù)金銀花的紅外光譜峰形、 峰位、 吸收強(qiáng)度等差異[7], 以及HPLC法測得的樣品中綠原酸、 當(dāng)藥苷、 斷氧化馬錢子苷、 木犀草苷、 異綠原酸A、 異綠原酸C的含量, 使用TQ analyst9軟件分析紅外圖譜, 建立金銀花的定量分析模型, 以期實現(xiàn)金銀花的快速含量測定。

1 實驗部分

1.1 儀器及分析軟件

Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司), BS-224S電子天平, MS105DU型半微量天平, KQ-500DV超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲波清洗器)等, INVENIO—HYPERION傅里葉變換紅外光譜儀(布魯克北京科技有限公司), 萬分之一分析天平AL204(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

Opus8.2.28軟件, TQ analyst9軟件, 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)。

1.2 材料

綠原酸(批號: 140322), 中國食品藥品檢定研究院; 異綠原酸 A(wkq18041207)、 異綠原酸 C (wkq18050905)、 當(dāng)藥苷(wkq18042610)均購置于維克奇生物科技有限公司; 斷氧化馬錢子苷(批號: P27N8L49194)、 木犀草苷(批號: Y26A9H59973)均購于源葉生物科技有限公司; 色譜甲酸(北京邁瑞達(dá)), 色譜甲醇、 色譜乙腈(Fisher Scientific), 甲醇(分析純, 天津富宇), 超純水等。

供試樣品購置2020年金銀花通貨, 河南30份、 河北15份、 山東19份, 經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

1.3 金銀花六種有效成分的測定方法

1.3.1 色譜條件

參照齊大明等[8]的高效液相方法, 測定結(jié)果見表1。

表1 六種成分含量(%)

續(xù)表1

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照 2020 藥典金銀花項下含量測定并進(jìn)行線性關(guān)系考察, 線性關(guān)系見表2。

表2 六種成分線性關(guān)系

1.4 金銀花定量模型的建立及成分測定

1.4.1 紅外光譜采集

將購置的64份金銀花樣品, 經(jīng)烘干處理后, 粉碎, 過四號篩。 使用傅里葉變換光譜儀對金銀花樣品采集紅外光譜圖, 采集光譜的參數(shù)為: 掃描范圍8 000～0 cm-1, 譜圖保存范圍為4 000～400 cm-1, 分辨率為4 cm-1, 掃描速度為7.5 kHz。 以空氣背景作為參照, 每次取樣約31 mg于ATR儀晶體上, 每個樣品20次重復(fù), 取平均光譜進(jìn)行分析。 隨機(jī)取其中16份金銀花樣品作為驗證集(HB4、 HB7、 HB10、 HB14、 HN2、 HN7、 HN9、 HN11、 HN17、 HN22、 HN23、 HN26、 SD3、 SD8、 SD13、 SD16), 其余48份樣品作為標(biāo)準(zhǔn)集。 64份原始圖譜見圖1。

圖1 64份金銀花的紅外原始圖譜

1.4.2 定量模型的建立

有效成分含量測定及目標(biāo)組分上下限設(shè)置, 上限最高為105%, 下限最低為95%, 結(jié)果見表3。

表3 目標(biāo)組分上下限范圍

光譜預(yù)處理: 采用偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元線性回歸(SMLR)、 多元散射校正(MSC)的方法, 然后用一階導(dǎo)數(shù)(1st)、 二階導(dǎo)數(shù)(2nd)及SG卷曲平滑和諾里斯導(dǎo)數(shù)濾波(ND)、 No Smoothing處理[9]。 以相關(guān)系數(shù)(R2)、 校正均方差(RMSEC)、 測定均方差(RMSEP)作為評價標(biāo)準(zhǔn), 校對不同預(yù)處理方法的定量模型建立的影響,R2值越大, 說明金銀花有效成分化學(xué)含量與紅外測定含量的相關(guān)性越好, RMSEC、 RMSEC越小, 說明所建模型的可靠性越好[10]。 預(yù)處理結(jié)果見表4。 由表中數(shù)據(jù)分析得到綠原酸以PLS+MSC+2nd Der+NS含量測定效果最好, 當(dāng)藥苷以PLS+MSC+1st Der+ND對含量測定效果最好, 斷氧化馬錢子苷以PLS+MSC+1st Der+SG對含量測定效果最好, 木犀草苷以PLS+MSC+1st Der+NS、 PLS+MSC+1st Der+SG以及PLS+SNV+1st Der+SG含量測定效果最好, 異綠原酸A以PLS+MSC+2nd Der+ND的含量測定效果最好, 異綠原酸C以PLS+MSC+2nd Der+SG的含量測定效果最好。

表4 光譜預(yù)處理結(jié)果

光譜范圍: 金銀花各種成分只出現(xiàn)在一定的紅外光譜范圍, 因此圖譜中每一段圖譜信息都表示代表著不同的化學(xué)成分。 如果僅對樣品的某個波段分析, 會有信息缺漏的可能, 因此為了能夠得到更準(zhǔn)確的相關(guān)波譜, 光譜參數(shù)的選擇根據(jù)軟件推選出的光譜范圍, 濾過噪音影響較大的光譜波段, 最終所選取的波段是3 855～745 cm-1。

模型建立: 運用偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元線性回歸(SMLR)、 多元散射校正(MSC)的方法, 用一階導(dǎo)數(shù)(1st)、 二階導(dǎo)數(shù)(2nd)及SG卷曲平滑、 No Smoothing處理建立金銀花的定量分析模型。 綠原酸的建模方法為PLS+MSC+2nd Der+NS, 相關(guān)系數(shù)為0.754 9, RMSEC值為0.356 0, RMSEP值為0.497 0; 當(dāng)藥苷的建模方法為PLS+MSC+1st Der+ND, 相關(guān)系數(shù)為0.936 9, RMSEC值為0.017 6, RMSEP值為0.038 0; 斷氧化馬錢子苷的建模方法為PLS+MSC+1st Der+SG, 相關(guān)系數(shù)為0.967 8, RMSEC值為0.043 9, RMSEP值為0.265 0; 木犀草苷的建模方法為PLS+MSC+1st Der+NS、 PLS+MSC+1st Der+SG以及PLS+SNV+1st Der+SG, 相關(guān)系數(shù)為0.859 0, RMSEC值為0.007 6, RMSEP值為0.010 0; 異綠原酸A的建模方法為PLS+MSC+2nd Der+ND, 相關(guān)系數(shù)為0.933 9, RMSEC值為0.126 0, RMSEP值為0.390 0; 異綠原酸C的建模方法為PLS+MSC+2nd Der+SG和PLS+SNV+2nd Der+SG, 相關(guān)系數(shù)為0.866 1, RMSEC值為0.034 2, RMSEP值為0.075 4。 綠原酸、 當(dāng)藥苷、 斷氧化馬錢子苷、 木犀草苷、 異綠原酸A、 異綠原酸C含量測定值與參考值的線性關(guān)系如圖2(a—f)。

圖2 測定值與參考值的線性參考圖

1.4.3 定量模型的驗證

將隨機(jī)抽取的驗證集10份樣品用于驗證所建定量模型的準(zhǔn)確性。 將紅外光譜輸入所建立的模型中, 測定金銀花樣品中有效成分的含量。 以絕對偏差作為性能指標(biāo)。 測定結(jié)果見表5。 建立的金銀花定量模型對綠原酸的平均絕對偏差為0.24%, 對當(dāng)藥苷的平均絕對偏差為0.00%, 對斷氧化馬錢子苷的平均絕對偏差為-0.06%, 對木犀草苷的平均絕對偏差為0.01%, 對異綠原酸A的平均絕對偏差為0.11%, 對異綠原酸C的平均絕對偏差為0.01%。 表明建立的綠原酸、 當(dāng)藥苷、 斷氧化馬錢子苷、 木犀草苷、 異綠原酸A、 異綠原酸C的方法具有良好得測定能力。

表5 驗證集樣品測定結(jié)果

2 結(jié) 論

紅外光譜定量原理是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或參考樣品的光譜信息, 運用化學(xué)計量學(xué)建立定量模型并進(jìn)行驗證, 然后用所建模型測定樣品組分的含量[11]。 傅里葉變化紅外光譜能夠提供中藥復(fù)雜混合物的整體特征信息, 利用紅外光譜技術(shù)對生中藥進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量評價目前更多的處于方法學(xué)探討之中[12-13]。 本研究將HPLC法與傅里葉變換紅外光譜技術(shù)相結(jié)合, 建立的金銀花六種有效成分的定量模型能夠?qū)崿F(xiàn)對金銀花中的綠原酸、 當(dāng)藥苷、 斷氧化馬錢子苷、 木犀草苷、 異綠原酸A、 異綠原酸C的含量進(jìn)行快速、 無損、 簡便的測定, 所建立的定量模型除了綠原酸外相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.85以上, 建立的定量模型較為客觀。

《中國藥典》對中藥材的質(zhì)量評價通常以有效成分的含量作為評價指標(biāo), 而傳統(tǒng)的檢測方法HPLC、 UV-Vis等避免不了復(fù)雜的樣品前處理、 難度較高的儀器操作以及中藥材的損耗等問題, 現(xiàn)代紅外光譜技術(shù)能夠很好地改善這些缺點, 具有掃描速度快、 操作簡便、 分析過程快速無損、 不需要樣品預(yù)處理、 應(yīng)用廣泛等優(yōu)點, 更重要的是可以實現(xiàn)大批量樣品的準(zhǔn)確測定, 這是傳統(tǒng)方法所不能實現(xiàn)的, 近幾年, 基于傅里葉變換紅外光譜技術(shù)陸續(xù)實現(xiàn)了地黃[4, 13]、 白芷[7]、 防風(fēng)[14]、 當(dāng)歸[15]、 肉桂[16]、 白芍[17]中有效成分的含量測定, 也預(yù)示著紅外光譜技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用趨勢日益增加。

紅外光譜作為一種新興技術(shù), 在定性定量分析中, 會受到樣品粉末大小、 均勻性、 溫度、 濕度、 光譜信號的識別等諸多因素的影響[11], 導(dǎo)致所采集的紅外譜圖出現(xiàn)誤差, 影響后期建模的效果, 因此運用紅外光譜技術(shù)建立定量模型要多次重復(fù)采集紅外譜圖以盡可能較小偶然誤差帶來的影響。 就目前研究水平, 制約了紅外光譜技術(shù)在中藥質(zhì)量控制的全面推廣應(yīng)用, 因此完善中藥材的光譜模型系統(tǒng)并提高模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確率, 是未來需要突破的重點。

將紅外光譜技術(shù)與高效液相色譜技術(shù)相結(jié)合可以實現(xiàn)中藥材含量的快速含量測定。 本研究所建立的金銀花定量模型穩(wěn)定、 可靠, 能夠?qū)崿F(xiàn)金銀花中有效成分的含量測定。 可以通過現(xiàn)代紅外光譜技術(shù)實現(xiàn)中藥材的快速、 無損檢測, 從而降低中藥材含量檢測成本, 提高中藥材含量檢測效率, 為保障中藥材質(zhì)量和安全提供參考依據(jù)。