γ-氨基丁酸對懷玉山三葉青低溫脅迫下試管苗生長及相關生理代謝的影響

洪森榮，余鍰媛，彭睿羚，劉雯莉，胡藤鑫，王玉婷（.上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 33400；2.上饒農(nóng)業(yè)技術創(chuàng)新研究院，江西 上饒 33400；3.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 33400；4.上饒市三葉青保育與利用技術創(chuàng)新中心，江西 上饒 33400）

三葉青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（Tetrastigma）植物，學名三葉崖爬藤，味苦、辛，性平或涼，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，以塊根或全草入藥，有“植物抗生素”“抗癌神草”等美譽，為民間珍稀中草藥[1]，始載于清代植物學專家吳其濬的《植物名實圖考》。三葉青常用于治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝炎、風濕、月經(jīng)不調(diào)、咽痛、瘰疬等癥，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗肝損傷、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等作用，臨床上多用于各種炎癥、病毒感染和癌癥的治療[2]。懷玉山三葉青主要分布在以懷玉山山脈為中心的贛、浙、皖、閩相交的高山山區(qū)，其莖葉含有牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素和牡荊素等抗癌活性成分，塊根的黃酮類成分有山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等[3]。懷玉山三葉青具有抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡等作用，可作為癌癥防治的功能性食品[4-8]。2016 年3 月31 日，原中華人民共和國農(nóng)業(yè)部正式批準對“懷玉山三葉青”實施農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護[9]。隨著懷玉山三葉青用途和應用領域的擴大，由于過度采挖導致懷玉山三葉青野生資源蘊藏量急劇下降，面臨枯竭[10]。2018 年3 月，懷玉山三葉青被江西省森林藥材與食品研究所推薦為“適宜林下套種栽培的中藥材品種”[11]。在低產(chǎn)經(jīng)濟林或毛竹林下套種懷玉山三葉青，既可以充分利用生態(tài)資源，發(fā)展林下經(jīng)濟；同時對于發(fā)展綠色無公害藥用植物種植、促進生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。但有研究[11]表明，在海拔800 m 以上區(qū)域的懷玉山三葉青，冬季地上部分會凍壞，甚至整株死亡，且越往海拔高的地方，植株凍死的比例越大。如何抗低溫脅迫是懷玉山三葉青仿野生栽培需要迫切需要解決的問題。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質氨基酸的植物分子信號[12]，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外環(huán)境酸堿度，維持碳氮營養(yǎng)平衡，參與植物對逆境脅迫的響應[13-14]。已有研究證實，外源GABA 處理能減輕桃[15-16]、香蕉[17]和蘋果[18]等果實采后低溫冷害的發(fā)生，增強油菜[19]、粳稻[20]和黃瓜[21]等幼苗的低溫抗性。本研究以懷玉山三葉青2 個栽培種“懷玉1 號”和“懷玉2 號”試管苗為材料，觀察繼代培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加GABA對低溫脅迫下試管苗生長及相關生理代謝的影響，以明確GABA在懷玉山三葉青組織培養(yǎng)中的作用，為懷玉山三葉青試管苗的高效、高質量繁育提供技術指導，并為GABA在懷玉山三葉青仿野生栽培中的防凍抗寒應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料懷玉山三葉青2 個栽培種“懷玉1 號”和“懷玉2 號”試管苗由上饒市三葉青保育與利用技術創(chuàng)新中心提供，經(jīng)上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司陳榮華高級農(nóng)藝師鑒定為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（Tetrastigma）植物三葉青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）。

1.2 方法

1.2.1 懷玉山三葉青試管苗生長指標的測定 取繼代培養(yǎng)的試管苗，切取其1.5 cm 的帶芽莖段，轉接到添加了GABA 的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基設置為基本培養(yǎng)基（MS）+1 mg·L-16-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg·L-1萘乙酸（NAA）+0～0.7 g·L-1GABA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂（pH 5.8）[22]。每種培養(yǎng)基設置為3 次重復，每次重復接種25 個莖段，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：光照強度30～40 μmol·m-2·s-1，光照時間14 h·d-1，溫度（5±1）°C。培養(yǎng)2 個月后，測定2 個試管苗的增殖系數(shù)（MC）（增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種莖段數(shù)）、株高（PH，cm）、鮮質量（FM，mg）和干質量（DM，mg），并計算試管苗的組織含水量（TWC，%）[（鮮質量-干質量）/鮮質量×100%][22]。

1.2.2 懷玉山三葉青試管苗生理指標的測定 根據(jù)“1.2.1”項下實驗結果，篩選有效促進低溫試管苗生長的較佳GABA 濃度，以此濃度GABA 處理的試管苗為處理組，以蒸餾水（即0 g·L-1GABA）處理的試管苗為對照組，處理組和對照組均置于低溫（5±1）°C 下進行培養(yǎng)試驗。培養(yǎng)至60 d 時分別取試管苗測定相關生理指標。內(nèi)源激素[吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）、赤霉素3（GA3）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）]的含量采用島津超高效液相色譜儀（LC-30AT）連接SCIEX 5600+質譜儀測定[23]；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定[24]；可溶性糖（SS）含量采用蒽酮比色法測定[25]；脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮比色法測定[26]；可溶性蛋白（SP）含量采用考馬斯亮藍G-520 法[25]測定；超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法[27]測定；過氧化氫（H2O2）含量采用H2O2試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定；還原型谷胱甘肽（GSH）含量采用HPLC 法[28]測定；抗壞血酸（AsA）含量采用Kampfenkel 等[29]的Fe3+還原法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法[30]測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[31]測定；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用黃真池等[32]的方法測定；谷胱甘肽還原酶（GR）活性采用李慧等[33]的方法測定。所有指標均重復3次。

1.2.3 懷玉山三葉青試管苗查爾酮合酶和黃酮醇合酶基因的實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測按“1.2.2”項下方法分組及培養(yǎng)三葉青試管苗。培養(yǎng)至60 d 時依據(jù)植物RNA 提取試劑盒（Omega）說明書分別提取懷玉1 號和懷玉2 號試管苗的總RNA。參考林國衛(wèi)等[34]的方法，驗證總RNA 的完整性、含量和純度。采用SuperRT cDNA 第一鏈合成試劑盒（CWBIO），按照說明書要求合成反轉錄cDNA 第一鏈。參考本實驗室[35]的方法，設計基因引物。查爾酮合酶（CHS）基因的引物為：（正向引物F）5’CACGAG TCCCACCTCGACTC3’；（反向引物R）5’AGGGGACG CTCCACGGACA3’，黃酮醇合酶（FLS）基因的引物為：（F）5’ATATGTACCCACCATGCCCACA3’；（R）5’CGGCGATCCAGTTATCGTCTT3’，以GAPDH 為內(nèi)參基因，進行qRT-PCR檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Microsoft Excel 2010 錄入、整理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示。運用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行分析，采用LSD法進行數(shù)據(jù)間的多重比較，并運用Duncan’s 法進行差異顯著性檢驗和Pearson 相關性分析。采用Microsoft Excel 2010進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗生長和組織含水量的影響GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗增殖倍數(shù)、株高、鮮質量及干質量的影響見表1。添加不同濃度的GABA（0.1～0.7 g·L-1）可以顯著促進低溫脅迫下試管苗增殖系數(shù)、株高、鮮質量及干質量的增加。其中，0.5 g·L-1GABA 的促進效應最好。與未添加GABA 的對照組相比，0.5g·L-1GABA 處理組試管苗的增殖系數(shù)、株高、鮮質量及干質量均達到最高值。與對照組比較，懷玉1號和懷玉2號試管苗的增殖系數(shù)分別增加1.77、1.89 倍，株高分別增加2.96、3.38 倍，鮮質量分別增加1.88、2.28 倍，干質量分別增加2.33、3.39 倍。不同濃度（0.1～0.7 g·L-1）的GABA 可以顯著增加低溫脅迫下懷玉1 號和懷玉2 號試管苗組織含水量。與對照組相比，0.5 g·L-1GABA 處理組懷玉1 號和懷玉2 號試管苗組織含水量均達到最高值，分別是對照組的1.08 倍和1.10倍。

表1 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗生長和組織含水量的影響（±s）Table 1 Effects of GABA on the growth and tissue water content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表1 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗生長和組織含水量的影響（±s）Table 1 Effects of GABA on the growth and tissue water content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指標不同小寫字母表示兩組間差異有顯著性（P＜0.05）

GABA 濃度/（g·L-1）0 0.1 0.3 0.5 0.7增殖系數(shù)懷玉1 號1.8±0.2c 2.1±0.4c 2.8±0.3b 3.2±0.6a 2.2±0.5c懷玉2 號77.0±8.2d 81.7±4.3c 82.8±6.2b 85.1±3.9a 83.5±5.9b懷玉2 號1.9±0.6c 2.2±0.5b 3.5±0.3a 3.6±0.5a 2.3±0.8b株高/cm懷玉1 號2.3±0.3e 3.4±0.8d 5.2±1.2b 6.8±0.9a 4.5±0.7c懷玉2 號2.6±0.5d 4.6±0.3c 6.5±0.7b 8.8±0.4a 6.8±0.3b鮮質量/mg懷玉1 號36.3±4.2e 41.6±6.2d 57.3±3.5b 70.4±8.8a 50.3±5.2c懷玉2 號38.7±6.5d 58.3±7.3c 76.6±4.5b 86.4±3.8a 74.5±2.9b干質量/mg懷玉1 號8.7±1.2c 8.6±2.5c 10.3±1.1b 12.6±3.2a 9.9±2.8b懷玉2 號8.9±2.1c 10.7±1.8b 12.8±2.2a 12.9±3.1a 12.3±2.4a組織含水量/%懷玉1 號76.3±5.6c 79.3±4.9b 82.2±3.3a 82.1±7.2a 80.3±6.1b

2.2 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗滲透調(diào)節(jié)物質含量的影響結果見表2。添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著增加低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量。與對照組相比，培養(yǎng)基中添加0.5g·L-1GABA，懷玉1 號和懷玉2 號試管苗可溶性蛋白含量分別增加47.66%和69.99%，可溶性糖含量分別增加46.76%和46.79%，脯氨酸含量分別增加47.47%和56.41%。

表2 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗滲透調(diào)節(jié)物質含量的影響（±s，mg·g-1）Table 2 Effect of GABA on the content of osmotic regulating substances in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，mg·g-1）

表2 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗滲透調(diào)節(jié)物質含量的影響（±s，mg·g-1）Table 2 Effect of GABA on the content of osmotic regulating substances in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，mg·g-1）

注：相同指標不同小寫字母表示兩組間差異有顯著性（P＜0.05）

GABA 濃度/（g·L-1）0 0.5可溶性蛋白懷玉1 號1.349±0.134b 1.986±0.256a懷玉2 號0.562±0.129b 0.879±0.092a懷玉2 號1.683±0.454b 2.861±0.652a可溶性糖懷玉1 號3.582±0.675b 5.257±0.872a懷玉2 號4.268±0.272b 6.265±0.429a脯氨酸懷玉1 號0.375±0.083b 0.553±0.182a

2.3 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗活性氧（ROS）含量及膜脂過氧化的影響結果見表3。添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著降低低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的相對電導率、H2O2含量、MDA含量和O2·-產(chǎn)生速率。與對照組相比，培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1GABA，懷玉1 號和懷玉2 號試管苗相對電導率分別降低32.96%和31.69%，H2O2含量分別降低35.46%和35.58%，MDA 含量分別降低22.24%和28.87%，O2·-產(chǎn)生速率分別降低33.44%和30.63%。

表3 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗活性氧含量及膜脂過氧化的影響（±s）Table 3 Effect of GABA on the content of ROS content and membrane lipid peroxidation in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表3 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗活性氧含量及膜脂過氧化的影響（±s）Table 3 Effect of GABA on the content of ROS content and membrane lipid peroxidation in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指標不同小寫字母表示兩組間差異有顯著性（P＜0.05）

GABA 濃度/（g·L-1）0 0.5相對電導率/%懷玉1 號24.38±2.23a 16.25±1.56b懷玉2 號16.29±2.84a 11.28±1.69b懷玉2 號18.24±1.89a 12.46±1.13b H2O2/（mmol·g-1）懷玉1 號36.18±4.55a 23.35±2.78b懷玉2 號31.25±3.18a 20.13±1.87b MDA/（μmol·g-1）懷玉1 號46.27±7.23a 35.98±4.19b懷玉2 號42.15±4.45a 29.98±3.26b O2·-產(chǎn)生速率/（μmol·g-1·min-1）懷玉1 號18.57±2.14a 12.36±1.28b

2.4 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗抗氧化物質含量及抗氧化酶活性的影響結果見表4。添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的GSH、AsA含量及SOD、POD、APX、GR活性。與對照組相比，培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1GABA，懷玉1 號和懷玉2 號試管苗GSH 含量分別提高84.67% 和72.52%，AsA 含量分別提高81.48%和90.62%，SOD 活性分別提高23.30%和38.63%，POD活性分別提高56.18%和79.91%，APX 活性分別提高61.22% 和64.13%，GR 活性分別提高40.50% 和50.74%。

表4 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗抗氧化物質含量及抗氧化酶活性的影響（±s）Table 4 Effect of GABA on the antioxidant content and antioxidant enzyme activity in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

表4 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗抗氧化物質含量及抗氧化酶活性的影響（±s）Table 4 Effect of GABA on the antioxidant content and antioxidant enzyme activity in T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s）

注：相同指標不同小寫字母表示兩組間差異有顯著性（P＜0.05）

GABA 濃度/（g·L-1）0 0.5 GSH/（μmol·g-1）懷玉1 號126.78±23.65b 238.11±36.28a懷玉2 號167.83±34.55b 289.54±26.82a AsA/（μg·g-1）懷玉1 號254.65±36.28b 462.15±39.05a懷玉2 號268.94±57.86b 512.64±76.23a SOD 活性/（U·g-1）懷玉1 號146.45±18.57b 180.58±32.88a懷玉2 號168.93±18.35b 238.19±32.16a GABA 濃度/（g·L-1）0 0.5 POD 活性/（U·g-1）懷玉1 號42.86±8.57b 66.94±12.41a懷玉2 號29.48±6.15b 43.57±8.31a懷玉2 號54.61±8.14b 98.25±12.67a APX 活性/（U·g-1）懷玉1 號3.88±1.53b 6.25±1.34a懷玉2 號5.63±1.24b 9.24±2.38a GR 活性/（U·g-1）懷玉1 號23.25±2.28b 34.68±4.16a

2.5 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗內(nèi)源激素含量的影響結果見表5。添加0.5g·L-1GABA 可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的IAA、ZR、GA3和JA 含量，降低其ABA 含量。培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1GABA，懷玉1 號和懷玉2 號試管苗IAA含量分別是對照組的4.44 倍和4.21 倍，ZR 含量分別是對照組的2.27 倍和2.22 倍，GA3含量分別是對照組的1.58 倍和1.66 倍，JA 含量分別是對照組的1.46 倍和1.39 倍，ABA 含量分別是對照組的68.10% 和62.74%。

表5 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗內(nèi)源激素含量的影響（±s，ng·g-1）Table 5 Effects of GABA on the endogenous hormone content of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，ng·g-1）

表5 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗內(nèi)源激素含量的影響（±s，ng·g-1）Table 5 Effects of GABA on the endogenous hormone content of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress（±s，ng·g-1）

注：相同指標不同小寫字母表示兩組間差異有顯著性（P＜0.05）

GABA 濃度/（g·L-1）0 0.5 IAA懷玉1 號2.85±1.03b 12.66±1.39a懷玉2 號38.23±2.27b 53.28±1.54a懷玉2 號3.86±0.98b 16.24±1.25a ZR懷玉1 號6.89±1.45b 15.63±3.76a懷玉2 號8.23±1.45b 19.26±2.87a GA3懷玉1 號24.68±3.15b 38.27±2.94a懷玉2 號26.28±3.26b 43.85±1.28a ABA懷玉1 號35.42±1.27b 24.12±2.85a懷玉2 號36.45±3.83b 22.87±2.51a JA懷玉1 號33.45±2.05b 48.82±1.19a

2.6 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗CHS和FLS 基因表達的影響結果見圖1。與對照組（0 g·L-1GABA）相比，經(jīng)0.5 g·L-1GABA 處理后可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的CHS基因的相對表達量（RQ 值），降低其FLS基因的相對表達量。培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1GABA 的懷玉1 號和懷玉2 號試管苗CHS基因的RQ 值分別是對照組的5.24 倍和8.24 倍，F(xiàn)LS基因的RQ 值分別是對照組的50.2%和33.4%。

圖1 GABA 對低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗CHS 和FLS 基因表達的影響Figure 1 Effect of GABA on CHS and FLS gene expression of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain under low temperature stress

2.7 低溫脅迫下GABA 處理的懷玉山三葉青試管苗生長與生理指標的相關性分析結果見表6。增殖系數(shù)（MC）與株高（PH）、鮮質量（FM）、干質量（DM）、抗壞血酸（AsA）含量、吲哚乙酸（IAA）含量、玉米素核苷（ZR）含量、赤霉素（GA3）含量、茉莉酸（JA）含量均呈非常顯著正相關關系（P＜0.01），與可溶性糖（SS）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）含量和查爾酮合酶（CHS）基因表達均呈顯著正相關關系（P＜0.05），但與黃酮醇合酶（FLS）基因表達呈非常顯著負相關關系（P＜0.01），與超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）含量和MDA 含量均呈顯著負相關關系（P＜0.05）。說明低溫脅迫下GABA 處理的懷玉山三葉青試管苗生長與吲哚乙酸（IAA）含量、玉米素核苷（ZR）含量、赤霉素（GA3）含量、茉莉酸（JA）含量、可溶性糖（SS）含量、抗壞血酸（AsA）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）含量和查爾酮合酶（CHS）基因表達的提高正相關。因此，適當濃度的GABA可以調(diào)控內(nèi)源植物激素和滲透調(diào)節(jié)物質含量、抗氧化物質含量以及次生代謝物關鍵基因表達，以促進低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長。

表6 低溫脅迫下GABA 處理的懷玉山三葉青試管苗生長與生理指標的相關性分析Table 6 Correlation analysis between growth and physiological indexes of T.hemsleyanum Diels et Gilg from Huaiyu Mountain plantlets treated by GABA under low temperature stress

3 討論

三葉青喜涼爽氣候，較耐低溫，在20～35 ℃時生長較好，冬春季平均溫度低于5～10 ℃時，三葉青停止生長[36]。在江西上饒地區(qū)，懷玉山三葉青懷玉1 號和懷玉2號在4～7月、9月下旬～11月下旬地上部分快速生長，其他季節(jié)處于緩慢生長或休眠狀態(tài)，在12 月～次年2 月由于溫度低于5 ℃時，會發(fā)生凍害，需要套袋抗凍[37]。本試驗結果表明，添加不同濃度（0.1～0.7 g·L-1）的GABA 可以顯著促進低溫脅迫下懷玉山三葉青2 個栽培種懷玉1 號和懷玉2 號試管苗增殖系數(shù)、株高、鮮質量及干質量的增加。其中，0.5 g·L-1GABA 的促進效應最好。本研究探究的低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗生長的GABA最適濃度與白明月等[22]在越橘試管苗以及宋春波[15]、方筱琴[16]和廖界仁[38]等在低溫脅迫下桃和茶樹的研究結果相同，但與鄭友峰[39]在低溫脅迫下莧菜的研究不同，究其原因，可能是因為植物種類存在差異所致。

在低溫脅迫下，植物為了適應寒冷的環(huán)境，其內(nèi)源激素含量會發(fā)生相應的變化，如低溫脅迫后不同溫敏性油菜的內(nèi)源IAA 和ABA 含量呈先上升后降低的趨勢[40]。低溫處理下，肉餅類兜蘭內(nèi)源IAA 含量顯著提高，而杏黃兜蘭IAA含量則顯著降低，黃花系肉餅兜蘭、紅花系肉餅兜蘭和杏黃兜蘭GA3和ZR 含量先增后減，ABA 含量在初期均突增[41]。GABA 是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，可作為信號分子調(diào)節(jié)植物抵抗逆境脅迫[42]。本試驗結果表明，與對照組（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青2 個栽培種懷玉1 號和懷玉2 號試管苗的IAA、ZR、GA3和JA 含量，降低其ABA含量。低溫脅迫下GABA處理引起懷玉山三葉青試管苗生長與生理指標的相關性分析也表明，低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長與IAA、ZR、GA3、JA 含量均呈非常顯著正相關關系。但白明月等[22]發(fā)現(xiàn)，添加0.5 g·L-1GABA 可顯著提高越橘試管苗IAA 和異戊烯基腺嘌呤（iPA）含量，降低ABA、GA3及茉莉酸甲酯（JA-me）含量。究其原因，可能是GABA處理越橘試管苗不是在低溫脅迫條件下。

植物的抗寒性與抗氧化系統(tǒng)密切相關。在遭受低溫脅迫時，植株體內(nèi)會產(chǎn)生大量ROS，從而引起膜脂過氧化程度增加，造成膜系統(tǒng)損傷，導致植物生理生化代謝紊亂，并嚴重抑制植物生長發(fā)育[43]，抗壞血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH））循環(huán)是植物體內(nèi)清除ROS 的重要途徑，其中AsA 和GSH 是AsA-GSH 循環(huán)中重要的抗氧化物質，既可直接還原ROS，又可以作為酶底物清除ROS[44]。同時植物還會以產(chǎn)生抗氧化酶等方式來清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧物質和自由基離子，從而抵御低溫產(chǎn)生的傷害[45]。本試驗結果表明，與對照組（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青懷玉1號和懷玉2號試管苗的GSH、AsA 含量及SOD、POD、APX、GR 活性。相關性分析也表明，低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長與AsA、GSH的含量呈顯著正相關關系。本試驗結果與白明月等[22]的越橘試管苗試驗的結果一致。

植物會產(chǎn)生一系列生理生態(tài)變化響應低溫脅迫。研究表明逆境脅迫引起的ROS[主要包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）等]大量積累將引起氧化脅迫[46]。這種氧化脅迫會導致植物細胞核酸功能發(fā)生改變，基因發(fā)生突變，蛋白質結構改變，酶活性降低，最終影響植物的正常生長發(fā)育[47]。細胞膜在植物抗逆性方面起著重要作用，膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與植物的抗逆性密切相關。在低溫脅迫下，細胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，產(chǎn)生過多的ROS，引發(fā)或加劇膜脂質過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損害。因此，清除ROS 是細胞膜保持良好穩(wěn)定性的關鍵[48]。本試驗結果表明，與對照組（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著降低低溫脅迫下懷玉山三葉青懷玉1號和懷玉2 號試管苗的相對電導率、H2O2含量、MDA 含量和O2·-產(chǎn)生速率。相關性分析也表明，低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長與O2·-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA 含量均呈顯著負相關關系。本試驗結果與白明月等[22]越橘試管苗試驗的結果一致。

在低溫脅迫下，植物的自身會產(chǎn)生對逆境的適應性反應，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質大量積累，使植物具有滲透調(diào)節(jié)的能力[49]。低溫脅迫時，細胞內(nèi)溶質主動積累，細胞滲透勢下降，這是滲透調(diào)節(jié)的關鍵，參與滲透調(diào)節(jié)的物質種類有很多，其中可溶性糖、可溶性蛋白質、游離脯氨酸等含量會發(fā)生變化，保持植物細胞原生質與環(huán)境的滲透平衡以適應逆境[50]。植物在低溫逆境條件下，通常以提高自身體內(nèi)的可溶性糖含量來抵抗寒冷；同時低溫脅迫還可引起植物體內(nèi)可溶性蛋白質含量遞增，并生成新的蛋白質，對植物的抗寒起到重要的調(diào)節(jié)作用；低溫脅迫容易造成植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量發(fā)生較大變化，植物對低溫脅迫的抗性強弱主要體現(xiàn)在游離脯氨酸積累的差異上[51]。本試驗結果表明，與對照組（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著促進低溫脅迫下懷玉山三葉青懷玉1 號和懷玉2 號試管苗可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的增加。相關性分析也表明，低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長與SS 含量呈顯著正相關關系。本試驗結果和賈琰等[20]越橘試管苗試驗的結果一致，但與白明月等[22]越橘試管苗試驗的結果不完全一致，與0 g·L-1GABA 相比，培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1GABA 后，越橘試管苗中可溶性蛋白含量無顯著變化，但可溶性糖和脯氨酸含量非常顯著增加。

在環(huán)境脅迫條件下，通過增加植物體內(nèi)黃酮化合物來防御環(huán)境脅迫，黃酮作為植物綜合防御體系的一部分，具有一定的清除氧自由基的能力[52]。CHS 是植物黃酮類化合物生物合成的關鍵限速酶，環(huán)境脅迫可誘導黃酮生物合成的關鍵酶CHS 的活性和含量上升[53]。類黃酮是植物次級代謝中很大的一個家族，其中黃酮醇是無色的次級代謝產(chǎn)物，F(xiàn)LS是類黃酮代謝中一個重要的節(jié)點酶[54]。黃酮醇在植物體內(nèi)有著重要的生物學功能，不僅可調(diào)控植物花色形成、保護植物抵御紫外損傷，還可作為信號分子響應營養(yǎng)脅迫、調(diào)控植物生長激素運輸?shù)茸饔肹55]。本試驗結果表明，與對照組（0 g·L-1GABA）相比，添加0.5 g·L-1GABA 可以顯著提高低溫脅迫下懷玉山三葉青懷玉1 號和懷玉2 號試管苗的CHS基因的相對表達量，促進黃酮生物合成，降低其FLS基因的相對表達量，減少黃酮醇生物合成。相關性分析也表明，低溫脅迫下懷玉山三葉青試管苗的生長與查爾酮合酶（CHS）基因表達均呈顯著正相關關系，但與黃酮醇合酶（FLS）基因表達呈非常顯著負相關關系。