血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳方法的優(yōu)化

閆巧梅,李 斌,張學(xué)明,孔凡青,高英辰,丁海麥

(包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040)

0 引言

電泳是指帶電粒子在電場中向與其電性相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)由于分子大小、形狀及所帶電荷不同,在同一電場條件下在介質(zhì)中移動(dòng)的速度不同,利用此特點(diǎn)將其分開的技術(shù)即電泳技術(shù)[1]。依據(jù)支持介質(zhì)不同可分為淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、濾紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳等。乙酸纖維素薄膜電泳因?qū)Φ鞍踪|(zhì)樣品吸附極少、快速省時(shí)、靈敏度較高,長期以來一直被廣泛用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)?？茖W(xué)研究及臨床檢驗(yàn)應(yīng)用乙酸纖維素薄膜電泳對(duì)血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子進(jìn)行分離檢測。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳受人為操作因素及環(huán)境因素影響較大,首次操作經(jīng)常出現(xiàn)血清蛋白分離效果較差的問題[1]。醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白,原來采用浙江臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠生產(chǎn)的乙酸纖維素薄膜,電泳緩沖液pH 8.6、離子強(qiáng)度為0.06 M/L的巴比妥緩沖液進(jìn)行分離,效果良好,但更換為成都菲爾斯特儀器有限公司的乙酸纖維素薄膜后,再用pH 8.6、離子強(qiáng)度為0.06 M/L的巴比妥緩沖液進(jìn)行血清蛋白分離,經(jīng)常存在血清蛋白條帶聚集、分不開的現(xiàn)象,其他使用單位也普遍存在這種情況,故有必要對(duì)醋酸纖維素薄膜的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)從緩沖液組成、離子強(qiáng)度、電泳時(shí)間及點(diǎn)樣片裝置進(jìn)行優(yōu)化,取得了較好、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乙酸纖維素薄膜(2 cm×8 cm,成都菲爾斯特儀器有限公司生產(chǎn)),新鮮兔血清。溴酚藍(lán)、巴比妥、巴比妥鈉、硼酸、硼砂、氯化鈉、麗春紅S均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。冰醋酸、無水乙醇為天津凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

醋酸纖維素薄膜電泳儀(北京六一生物科技有限公司生產(chǎn),型號(hào)DYCP-38C),電泳儀電源(BG-Power600K),微量移液器,濾紙,薄塑料片(與蓋玻片厚度相當(dāng)),培養(yǎng)皿,鑷子,濾紙等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

pH 8.6、離子強(qiáng)度0.075 M/L巴比妥緩沖液[2](稱取巴比妥鈉15.45 g,巴比妥2.76 g,用去離子水溶解定容至1000 mL);pH 8.6、離子強(qiáng)度0.025 M/L巴比妥緩沖液(稱取巴比妥鈉5.15 g,巴比妥0.92 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)[3];pH 8.6、離子強(qiáng)度0.05 M/L硼酸緩沖液(稱取硼酸6.7 g,硼砂13.4 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)[4-5];pH 8.6、離子強(qiáng)度0.08 M/L硼酸緩沖液[2](稱取硼酸5.6 g,硼砂5.61 g,氯化鈉1.32 g,用去離子水溶解定容至1000 mL)。

麗春紅染色液:稱取麗春紅S 0.1 g,溶液5 mL冰醋酸,去離子水溶解定容至100 mL。

漂洗液:量取95%乙醇45 mL,加冰醋酸5 mL,混勻后,用去離子水稀釋至100 mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)備電泳槽。取4個(gè)乙酸纖維素薄膜電泳儀,槽內(nèi)分別加入4種緩沖液,保證電泳槽內(nèi)液面高度相等,剪裁尺寸合適的雙層濾紙條,濾紙條一端與電泳槽的支架的前沿對(duì)齊,另一端浸入電泳槽的緩沖液內(nèi),使濾紙緊貼在支架上,待濾紙全部濕潤后,驅(qū)除濾紙與支架間氣泡,便可用于薄膜電泳。

浸膜。將乙酸纖維薄膜磨面朝下,分別置于4種不同緩沖液中,膜自然沉降,至少浸泡30 min,確保薄膜浸透。

血清預(yù)處理。吸取200 uL兔新鮮血清,放入500 uL EP管中,用200 uL微量移液器吸頭蘸取少量溴酚藍(lán),再用微量移液器輕輕反復(fù)吹打血清,待溴酚藍(lán)溶解,血清染成藍(lán)色,將預(yù)染的200 uL血清吸到玻璃板上,并將血清涂成薄薄一層覆蓋在玻璃板上(厚度約1 mm圖1)。

圖1 預(yù)染血清涂成薄薄一層Fig.1 Pre stained serum coated in a thin layer

加樣。用鈍頭鑷子從浸膜液中夾一張乙酸纖維薄膜,用濾紙輕輕吸去醋酸纖維薄膜上多余的緩沖液,磨面朝上,用自制加樣片(厚度與蓋玻片相當(dāng)?shù)谋∷芰掀舫?.6 cm×5 cm,3片疊放在一起用透明膠帶固定,圖2)蘸取玻璃板上血清,在距膜一端1.5 cm處,將血清印在膜上,待樣品滲入薄膜后移開,使其形成具有一定寬度、精細(xì)勻稱的矩形,每張膜加2個(gè)樣品(圖3)。整個(gè)加樣過程盡可能快,保持薄膜始終處于濕潤狀態(tài),印跡可能要小、整齊,避免擴(kuò)散面積過大。

圖2 自制加樣片F(xiàn)ig.2 Self made sampling piece

圖3 膜加樣后效果Fig.3 Effect of membrane sampling

電泳。將加樣后的薄膜磨面朝下放置于電泳槽支架雙層濾紙上,保證加樣端置于電泳槽陰極端濾紙,薄膜條平直,與濾紙貼緊,用圓珠筆做好標(biāo)記,蓋好電泳槽蓋,靜止平衡10 min,打開電泳儀電源,將調(diào)節(jié)電壓調(diào)至恒壓100 V,電泳70 min。

染色與漂洗。電泳結(jié)束后,將薄膜置于麗春紅染色液中,染色5 min,取出后用漂洗液漂洗3次,每次5 min,直至薄膜背景色為無色,取出用濾紙吸干漂洗液,辨認(rèn)電泳圖譜中各蛋白區(qū)帶。

電泳緩沖液與電泳時(shí)間優(yōu)化。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果及能否分離出5條區(qū)帶,選取理想的緩沖液。恒壓100 V,選取電泳時(shí)長為40 min、50 min、55 min的3個(gè)時(shí)間段,對(duì)電泳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,保證漂洗后薄膜上可顯現(xiàn)清楚的5條區(qū)帶,選擇電泳時(shí)長最短的為最佳電泳時(shí)長。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 電泳緩沖液選擇

按要求加好樣后,蓋好電泳槽蓋,平衡10 min,接通電源,將電壓調(diào)到100 V進(jìn)行恒壓電泳,電泳70 min后,經(jīng)麗春紅染色5 min,漂洗液漂洗3次,保證將薄膜漂洗成無色,取出用濾紙吸干漂洗液。將乙酸纖維素薄膜放到A4紙上,觀察pH 8.6,離子強(qiáng)度0.075 M/L、0.025 M/L巴比妥緩沖液;pH 8.6,離子強(qiáng)度0.05 M/L、0.08 M/L硼酸緩沖液的電泳圖譜,結(jié)果顯示,只有0.08 M/L硼酸緩沖液電泳圖譜能顯示出5條區(qū)帶(圖4),而其他3種緩沖液不是蛋白區(qū)帶聚集,就是擴(kuò)散,分辨不出5條區(qū)帶。雖然pH 8.6,離子濃度0.08 M/L硼酸緩沖液電泳圖譜能清晰顯示出5條區(qū)帶,從左到右依次為γ球蛋白、β球蛋白、α2球蛋白、α1球蛋白、白蛋白。但蛋白區(qū)帶γ球蛋白、α1球蛋白存在擴(kuò)散現(xiàn)象,不利于結(jié)果判斷,其原因與電泳時(shí)間偏長有關(guān),需對(duì)電泳時(shí)長進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.加樣點(diǎn);2.γ球蛋白;3.β球蛋白;4.α2球蛋白;5.α1球蛋白;6.白蛋白。圖4 血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳圖譜Fig.4 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

3.2 電泳時(shí)間選擇

不同電泳時(shí)長對(duì)醋酸纖維素薄膜電泳的圖譜有一定的差異。用pH 8.6、離子濃度0.08 M/L的硼酸緩沖液,電泳恒壓100 V,將電泳時(shí)長設(shè)置為40 min、50 min、55 min 3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行優(yōu)化,電泳結(jié)束后,經(jīng)麗春紅染色,漂洗液將薄膜漂洗成無色,取出用濾紙吸干漂洗液,將乙酸纖維素薄膜放到A4紙上,觀察3個(gè)時(shí)長的電泳圖譜(圖5)。結(jié)果顯示,電泳時(shí)長為40 min時(shí),α2球蛋白與β球蛋白分離不太明顯;電泳時(shí)長為55 min時(shí),γ球蛋白條帶出現(xiàn)擴(kuò)散,綜合分析電泳時(shí)長為50 min時(shí),乙酸纖維素薄膜圖譜上血清蛋白5條帶清晰可辨,結(jié)果比較理想。

a.電泳時(shí)長40 min;b.電泳時(shí)長50 min;c.電泳時(shí)長55 min。圖5 血清蛋白乙酸纖維素薄膜電泳圖譜Fig.5 Serum protein cellulose acetate film electrophoresis pattern

4 結(jié)果分析與討論

乙酸纖維素是纖維素羥基經(jīng)乙酰化形成的纖維素乙酸酯,將其溶于丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑后,涂抹成均勻的薄膜則成為乙酸纖維素薄膜,具有細(xì)密微孔結(jié)構(gòu),滲透性強(qiáng),對(duì)電泳物質(zhì)移動(dòng)阻力小,對(duì)樣品無拖尾及吸附現(xiàn)象。該電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、同工酶的分離及測定中。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大多低于pH 7.0,在pH 8.6的緩沖液中,均解離成陰離子,在電場中向陽極移動(dòng)。血清中不同蛋白質(zhì)所帶電荷、分子大小及形狀各不相同,故在電場中的泳動(dòng)速度不同,電泳結(jié)束后停留在乙酰纖維素膜的不同位置。

緩沖液離子濃度與成分是影響乙酸纖維素電泳的關(guān)鍵因素,更換不同廠家薄膜后,應(yīng)對(duì)電泳緩沖液進(jìn)行優(yōu)化。目前乙酸纖維素電泳緩沖液主要有pH 8.6的巴比妥緩沖液和硼酸緩沖液,離子強(qiáng)度通常為0.02～0.2 mol/L,緩沖液離子強(qiáng)度越大,樣品的電泳速度減慢,離子強(qiáng)度增加使電泳時(shí)的總電流及產(chǎn)熱增加,對(duì)電泳不利。更重要的是,巴比妥為麻毒類藥品,存在實(shí)驗(yàn)室安全潛在風(fēng)險(xiǎn),需尋求替代巴比妥緩沖液。而硼酸及其鈉鹽臨床上可用于生產(chǎn)硼酸軟膏、消毒劑、收斂劑、防腐劑等,安全低毒,是理想的替代品[6]。研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)室電泳所用乙酸纖維素薄膜用pH 8.6、離子濃度0.08 M/L的硼酸緩沖液完全可以取代巴比妥緩沖,且效果遠(yuǎn)優(yōu)于巴比妥緩沖液。

加樣是影響乙酸纖維素電泳的關(guān)鍵因素,蓋玻片或X光片單層吸附血清較差,稍有不慎會(huì)造成加樣過多、過少或靠近膜邊緣,電泳圖譜會(huì)出現(xiàn)蛋白條帶拖尾、分離不佳或條帶彎曲。加樣前,將預(yù)染血清200 uL在玻璃板上涂成薄薄一層(厚度1～2 mm);再用3片疊放在一起的自制加樣片,在薄薄血清中輕輕蘸取一下,加樣片吸附的血清大約1 uL,保證加樣量合適,在膜上印跡后寬度合適均勻。1張膜同時(shí)加兩個(gè)樣品,可減少膜的使用量,節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

蛋白質(zhì)乙酸纖維素電泳染色的常用染料有氨基黑10B和麗春紅S兩種,均屬于酸性染料,與蛋白質(zhì)中的精氨基酸、賴氨基酸等帶正電荷的堿性氨基酸相結(jié)合,蛋白質(zhì)顯示黑色或紅色條帶。

血清乙酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)想要獲得理想的分離條帶,關(guān)鍵是要做到乙酸纖維素薄膜與緩沖液的離子成分與摩爾濃度相匹配,在確保分離效果的前提下,盡可能縮短電泳時(shí)間,提升實(shí)驗(yàn)效率。乙酸纖維素薄膜用pH 8.6、離子強(qiáng)度0.08 M/L硼酸緩沖液,電壓100 V,電泳時(shí)長50 min,分離兔血清蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較理想,能代替巴比妥緩沖液。