大蒜素有效成分DATS對糞腸球菌抑制作用的體外研究

王立媛 申思敏 白錫靜

目前根管治療(root canal therapy, RCT)是治療牙髓炎和根尖周炎最有效的方法[1]。然而機(jī)械-化學(xué)預(yù)備手段并不能完全清除根管內(nèi)的微生物[2-3],即使經(jīng)過“完善”的RCT,仍有4%～15%的失敗率[4],失敗的主要原因是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)等致病菌引起根管內(nèi)的持續(xù)感染[5-6]。徹底清除這些頑固致病菌,防止再感染,提高根管治療質(zhì)量,是目前口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一[7-8]。

大蒜素是天然植物大蒜的提取物,生物安全性好,抗菌效果明顯,被譽(yù)為“廣譜抗生素”,其主要抗菌成分是二烯丙基化三硫(dially trisulfide, DATS),多項(xiàng)研究證實(shí)大蒜素及其衍生物對多種細(xì)菌具有抗菌作用。目前大蒜素對E.faecalis作用的研究報(bào)道較少。本研究將大蒜素抗菌成分DATS與臨床常用的氫氧化鈣制劑作比較,觀察這種天然藥物對E.faecalis的殺滅效果,為牙髓病和根尖周病的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

糞腸球菌(標(biāo)準(zhǔn)株,ATCC 29212)、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品(二烯丙基三硫化物 DATS)、 BHI微生物培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司); BHIA培養(yǎng)基90 mm(常德比克曼生物有限公司); 氫氧化鈣糊劑(Well-Paste VERICOM,韓國); 電子分析天平(奧豪斯,美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜素溶液配制 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品DATS溶解于DMSO中,充分震蕩,配制成20 mg/mL的原液,分裝至無菌聚丙烯小管內(nèi),存于-80 ℃冰箱,用時(shí)取出,BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行微量稀釋法稀釋。

1.2.2 糞腸球菌菌液配制 按說明書復(fù)蘇糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株,接種于血瓊脂固體培養(yǎng)基中, 37 ℃, 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,超凈臺內(nèi)觀察菌落生長情況和菌落形態(tài),確認(rèn)為純培養(yǎng)。挑取3個單菌落,用無菌接種環(huán)接種至BHI液體培養(yǎng)基中,比濁儀校正濃度至0.5 mol/L,稀釋100 倍(約1×106CFU/mL)后備用。

1.2.3 DATS最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 采用液體二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC): 用BHI液體培養(yǎng)基將DATS溶液在96 孔板連續(xù)二倍稀釋,濃度依次為10 240、 5 120、 2 560、 1 280、……20 μg/mL,每孔加DATS溶液180 μL,加菌懸液20 μL。設(shè)立不含DATS的陽性菌液對照組和不含DATS也不含菌懸液的BHI 培養(yǎng)基陰性對照組。同時(shí)設(shè)立3 個平行對照。37 ℃培養(yǎng)過夜,以肉眼觀察液體清亮無混濁的最低藥物濃度為DATS的MIC值。

將未見細(xì)菌生長的各孔培養(yǎng)物,用無菌接種環(huán)接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基平皿,厭氧培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)基平皿無菌落生長的最低藥物濃度即為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)。

1.2.4 DATS對糞腸球菌生物膜的抗菌作用

1.2.4.1 離體牙的收集與預(yù)備 經(jīng)天津市口腔醫(yī)院臨床研究倫理委員會審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號: PH2021-B-001),選取2021 年10 月～2022 年1 月間因牙周病或正畸原因拔牙的健康單根管牙60 顆,年齡為15～50 歲。在本研究中,選取彎曲度不大于10°的牙根。用刀片清除離體牙表面的牙石及軟組織等附著物,保存在0.01% NaClO溶液中, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用5.25% NaClO浸泡牙齒標(biāo)本24 h。 使用600目金剛砂紙打磨,去除牙根表面的牙骨質(zhì)。常規(guī)開髓、摘除牙髓,用登士柏Protaper 及廠家推薦操作流程,進(jìn)行根管預(yù)備至F3。每次更換銼針均使用5.25% NaClO與17% EDTA交替沖洗,預(yù)備完成后超聲震蕩沖洗根管。使用金剛砂片磨除牙齒的冠方及根尖區(qū),保留根中段圓柱形牙根,長度約為6 mm。分裝于BHI液體培養(yǎng)基中, 121 ℃、 1.5 MPa滅菌15 min,靜置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi), 24 h后觀察無渾濁,確定完全滅菌。 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 分組 預(yù)備好的牙根60 個,隨機(jī)分為4 組(n=15)。各組處理如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)分組 (n=15)

1.2.4.3 感染模型制備 取45 顆牙根建立根管感染模型。分裝有牙根的離心管中注入標(biāo)準(zhǔn)菌液建立感染模型,置于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育28 d, 每2 d更換1 次菌懸液。在整個過程中嚴(yán)格無菌操作。孵育結(jié)束后延牙體長軸剖開,掃描電鏡觀察E.faecalis生物膜形成情況。

1.2.4.4 放置根管消毒劑及檢測消毒效果 無菌生理鹽水蕩洗根管,干燥后,以黏蠟封閉底部根管口,并將牙根固定于六孔板中,每孔1 顆牙根。

按表1所示,使用無菌注射器將藥物分別注入根管內(nèi)。將六孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi),分別于實(shí)驗(yàn)第1 天、第3 天和第7 天,每組取出5 個標(biāo)本,無菌生理鹽水蕩洗去凈根管內(nèi)試驗(yàn)藥物,干燥后,滅菌慢速球鉆均勻磨除根管內(nèi)層牙本質(zhì),電子天平稱取4 mg牙本質(zhì)粉末,置于2 mL BHI液體培養(yǎng)基無菌試管中,培養(yǎng)72 h。取肉湯上層液體,以電子比濁儀讀取濁度,記錄數(shù)值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,各組不同時(shí)間點(diǎn)的濁度值比較選用單因素方差分析(表2), 不同實(shí)驗(yàn)組間同一時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用Tamhane法,各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用LDS法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末培養(yǎng)上層液體濁度

2 結(jié) 果

2.1 DATS最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

采用倍比稀釋法測定DATS的MIC值為2 560 μg/mL, MBC值為5 120 μg/mL。

2.2 感染模型的建立

掃描電鏡觀察顯示大部分牙本質(zhì)小管內(nèi)有細(xì)菌生長 (圖1),細(xì)菌侵入深度可達(dá)500 μm,感染模型建立成功。

圖1 牙本質(zhì)小管感染糞腸球菌的模型建立(SEM, ×6 000)

2.3 藥物對糞腸球菌生物膜的抗菌作用

第1 天時(shí), DATS組、氫氧化鈣糊劑組渾濁度顯著低于陽性對照組,有明顯抑菌效果,差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩實(shí)驗(yàn)組渾濁度顯著高于陰性對照組(P<0.05),仍有細(xì)菌生長;DATS組抗菌效果顯著優(yōu)于氫氧化鈣組(P<0.05) (圖2)。DATS組,第3 天和第7 天的渾濁度與陰性對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05),已無細(xì)菌生長。氫氧化鈣糊劑組,第3 天較第1 天殺菌作用更明顯(P<0.05);第3 天與第7 天渾濁度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05);各時(shí)間點(diǎn)渾濁度顯著高于陰性對照組(P<0.05),均有細(xì)菌生長(圖3)。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末培養(yǎng)上層液體濁度

圖3 同一組不同時(shí)間點(diǎn)根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末培養(yǎng)上層液體濁度

3 討 論

E.faecalis是革蘭氏陽性菌,腸球菌屬,存在于人體的口腔、呼吸道、腸道等多個部位,是一種條件致病菌, 被認(rèn)為是感染根管中最難清除的菌種之一[9]。是難治性根尖周炎、根管治療失敗再感染根管的主要致病菌[10]。杜琛[11]和李瑩雪等[12]研究發(fā)現(xiàn),E.faecalis在根管治療后持續(xù)或繼發(fā)性感染根管中具有較高的檢出率。 Zheng 等[13]的實(shí)驗(yàn)表明,E.faecalis能高度耐受低氧、高鹽、寡營養(yǎng)的惡劣環(huán)境,并快速獲得抗藥性和形成生物膜[14-15]。同時(shí),E.faecalis還表現(xiàn)出對堿性脅迫的抗性[16-17]。這些特性使E.faecalis成為根管治療失敗的一個難題。本實(shí)驗(yàn)對不易產(chǎn)生耐藥并具有抗菌作用的中藥大蒜素對E.faecalis的抑菌作用進(jìn)行研究。

氫氧化鈣具有抗菌性,可以殺滅或抑制感染根管中的多種細(xì)菌[18],能夠減輕牙髓炎和根尖周炎患者的疼痛程度,被廣泛應(yīng)用于臨床[19]。氫氧化鈣是接觸性消毒藥物,殺菌作用主要依靠其高堿性。即使飽和的氫氧化鈣,仍不能對牙本質(zhì)上的E.faecalis生物膜達(dá)到良好的清除效果[17]。一方面,E.faecalisd的菌體直徑小于牙本質(zhì)小管的直徑[20],可在牙本質(zhì)小管和管間牙本質(zhì)定植,氫氧化鈣彌散性差,難以直接作用殺滅細(xì)菌[21];另一方面,E.faecalis可通過細(xì)胞質(zhì)的緩沖能力和“質(zhì)子泵”機(jī)制保持菌體內(nèi)pH值的平衡[22-23],同時(shí)天然牙本質(zhì)具有降低氫氧化鈣pH值的能力。本研究使用臨床常用的pH值為11的成品氫氧化鈣糊劑,作用于E.faecalis感染根管模型,比較不同時(shí)間點(diǎn)根管內(nèi)壁的感染情況。結(jié)果顯示:第1 天開始?xì)溲趸}糊劑組牙本質(zhì)小管中殘留細(xì)菌量明顯減少(P<0.05),第1、 3、 7 天均與陰性對照組存在顯著性差異,提示氫氧化鈣對E.faecalis有殺菌效果,但不能完全清除細(xì)菌。其中第7 天較第3 天,菌量雖有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因與氫氧根消耗減少和氫氧化鈣本身沒有揮發(fā)性及擴(kuò)散能力,使其無法對牙本質(zhì)小管深層的細(xì)菌及其毒素起作用有關(guān)。因此,氫氧化鈣無法對感染根管中的E.faecalis起到較好的殺滅或抑制作用。

大蒜為百合科蔥屬類植物,以鱗莖入藥,是一種傳統(tǒng)中藥,古人很早就發(fā)現(xiàn)其具有藥用價(jià)值[24],因其生物安全性好,抗菌效果明顯,被譽(yù)為“廣譜抗生素”[25]。大蒜素是大蒜提取物的多種成分的總稱,含有多種生物活性化合物,其中DATS是多種大蒜提取物中占比最高的一種硫化物,約占所有混合大蒜素的41.5%[26]。有多項(xiàng)研究表明:DATS的生理活性作用更有效[27]。大蒜素的抗菌機(jī)制主要與菌體巰基酶的競爭性抑制[28]、對病原微生物菌體結(jié)構(gòu)的侵入和破壞[29]、生物被膜的抑制和消散[30], 以及DATS的作用靶點(diǎn)及多重抑制效應(yīng)等有關(guān)[31]。本研究選用大蒜素的有效成分DATS進(jìn)行研究,成分單一,抗菌效果明確。

王祥柱等[32]研究顯示,高濃度(5 120 mg/L)DATS對饑餓期E.faecalis生物膜抑菌抗菌效果較好。本實(shí)驗(yàn)采用倍比稀釋法測定DATS的最小殺菌濃度為5 120 μg/mL,與該學(xué)者的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)中比較不同藥物對E.faecalis的殺菌效果,也選用5 120 μg/mL的DATS。劉琳[33]選用12 mg/mL的大蒜素注射液與甲醛甲酚(FC)進(jìn)行比較,其殺菌效果與FC無明顯差異,證實(shí)大蒜素對E.faecalis明確的滅菌效果,并具有明顯低于FC的毒性。本研究結(jié)果顯示, 5 120 μg/mL的DATS第1 天時(shí)已顯示對E.faecalis明顯的殺滅效果, 第3 天時(shí)可以將E.faecalis全部殺滅,效果優(yōu)于對照組的臨床常用的氫氧化鈣糊劑。進(jìn)而證實(shí)了大蒜素對生物膜狀態(tài)的E.faecalis有明確的抑制與殺滅效果,提示可以將大蒜素用于難治性感染根管的治療,具有強(qiáng)于氫氧化鈣的殺菌抑菌效果和揮發(fā)性的優(yōu)勢。

大蒜素是大蒜中分離提取出的化合物,抗菌效果明顯,不易產(chǎn)生耐藥性。對難治性感染根管的E.faecalis生物膜有殺滅效果。但大蒜素有刺激性氣味,遇熱不穩(wěn)定,從而減弱甚至喪失功效,使其在臨床上的應(yīng)用受到一定的限制。大蒜素進(jìn)一步應(yīng)用于口腔臨床治療還有賴于對其藥理作用在分子水平上的深入研究,以及對大蒜素制劑的進(jìn)一步研制。