濾過型固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中15種全氟化合物的含量

吳 坤,吳玉田,趙 君,周貽兵

(1.貴州師范學院 化學與材料學院,貴陽 550018; 2.貴州省疾病預防控制中心 實驗中心,貴陽 550004)

全氟化合物(PFCs)是一類烷基上氫原子全部被氟原子取代的人工合成化合物,因具有獨特的疏水疏油性、耐熱性及高表面活性等理化性質,被廣泛應用于紡織、滅火劑、殺蟲劑等領域[1-2]。隨著PFCs規(guī)模化生產和使用,大量的PFCs被排放到環(huán)境中。由于PFCs具有持久性、生物積累性,難以光解、水解和被生物降解,潛在毒性以及長距離遷移等特性,從而導致環(huán)境介質、生物體和食品中普遍檢出PFCs。研究表明,PFCs可通過食物鏈逐級放大并蓄積在人或動物體內,從而產生多種毒性效應,甚至導致器官衰竭或癌變[3-6]。因此,PFCs污染已成為全球性問題,對人類健康構成潛在威脅。近年來,為了降低PFCs的健康風險,各國政府和行業(yè)逐漸重視PFCs的源頭管控,逐步減少、限制含PFCs原料的生產、貿易和使用,逐步加強食品接觸材料在內的產品風險管控。2020年歐洲食品安全局建議全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸(PFNA)、全氟己烷磺酸(PFHxS)和全氟辛烷磺酸(PFOS)等4種PFCs的每周允許攝入量為8 ng·kg-1(根據體重計算),但是世界各國沒有明確食品中PFCs的限量要求,僅提示關注PFCs的使用和風險管控。膳食暴露被學術界公認為是非職業(yè)暴露人群暴露PFCs的主要原因,高蛋白類食物是膳食暴露PFCs的重要來源[7-9]。雞蛋作為百姓日常膳食中最主要的動物源性蛋白之一,其食用安全不容忽視,但PFCs通常為痕量水平,因此開發(fā)雞蛋中PFCs的快速、靈敏、準確的檢測技術具有重要的實際應用價值。

PFCs帶有極性基團,沸點較高,難揮發(fā),若使用氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜法[11]檢測則需要衍生化前處理,操作繁瑣;而且PFCs分子結構中沒有紫外吸收基團或熒光發(fā)射基團,不能直接利用液相色譜-紫外檢測器或熒光檢測器進行檢測[12]。液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、重現性好、抗干擾性強等特點,結合不同類型樣品前處理手段成為PFCs的主流分析方法[13-16]。目前,PFCs前處理主要采用酸、堿或離子對試劑使其離子化后,用混合型弱陰離子交換固相萃取小柱(WAX柱)凈化[17],此過程操作繁瑣、耗時長,且容易堵塞凈化柱。因此,本工作采用乙腈溶液振蕩和超聲提取后,使用濾過型Captive EMR-Lipid柱凈化,提出了超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中全氟丁酸(PFBA)、全氟戊酸(PFPeA)、全氟己酸(PFHxA)、全氟庚酸(PFHpA)、PFOA、PFNA、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA)、全氟十二酸(PFDoDA)、全氟十三酸(PFTrDA)、全氟十四酸(PFTeDA)以及全氟丁烷磺酸(PFBS)、PFHxS、全氟庚烷磺酸(PFHpS)、PFOS等15種PFCs含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Exion LCTM型超高效液相色譜儀;6500+Q-TRAP型三重四極桿-線性離子阱復合質譜系統(tǒng);BSA 224S-CW型電子天平;Milli-Q型超純水儀;KEYINTECH型混勻器;HS 6150 T型超聲波清洗器;3-18K型高速冷凍離心機;N-EVAP 112型氮吹儀。

15種PFCs混合標準溶液：2 000 μg·L-1,包括PFBA、PFPeA、PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA、PFTrDA、PFTeDA、PFBS、PFHxS、PFHpS、PFOS等15種PFCs。使用時,用甲醇稀釋至所需質量濃度。

11種PFCs同位素混合內標溶液：2 000 μg·L-1,包括13C4-PFBA、13C5-PFPeA、13C2-PFHxA、13C4-PFHpA、13C4-PFOA、13C5-PFNA、13C2-PFDA、13C2-PFUnDA、13C2-PFDoDA、18O2-PFHxS、13C4-PFOS等11種PFCs同位素內標。使用時,用甲醇稀釋至所需質量濃度。

甲醇、乙腈均為色譜純;乙酸銨為質譜級;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫40 ℃;流動相A為2 mmol·L-1乙酸銨溶液,B為甲醇;流量0.3 mL·min-1;進樣體積5 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子(ESI-)模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;噴霧電壓-4 000 V;離子源溫度450 ℃;氣簾氣壓力241 kPa,霧化氣壓力344 kPa,去溶劑氣壓力310 kPa;其他質譜參數見表2,其中“*”代表定量離子。

表2 質譜參數

1.3 試驗方法

雞蛋樣品采集于超市,每份采集10個。將雞蛋去殼后,攪拌均勻,置于聚丙烯塑料離心管中,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩z測前,將樣品恢復至室溫,搖勻。稱取2 g(精確至0.001 g)于15 mL聚丙烯離心管中,加入0.1 mL 20.0 μg·L-1混合內標溶液、10 mL 80%(體積分數,下同)乙腈溶液,振蕩10 min,超聲15 min后,于4 ℃以轉速10 000 r·min-1離心5 min。分取5 mL濾液(樣品提取液),直接過Captive EMR-Lipid柱,收集流出液于聚丙烯離心管中,于60 ℃水浴氮吹至近干,加入500 μL甲醇,渦旋混勻,以轉速10 000 r·min-1離心5 min,取上清液,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

PFCs中的氫原子被氟原子取代,且含有羧基和磺酸基,是酸性化合物,在ESI源中易形成[M-H]-離子,常采用ESI-模式進行檢測。將50.0 μg·L-1的PFCs混合標準溶液和混合內標溶液以8 μL·min-1的流量注入質譜儀進行全掃描,優(yōu)化去簇電壓、霧化氣壓力等參數;然后對[M-H]-母離子進行碰碎。結果表明,羧酸型PFCs易發(fā)生中性丟失CO2產生[M-H-44]-子離子,磺酸型PFCs易斷裂生成[FSO3]-和[SO3]-子離子。分別選擇響應值高、穩(wěn)定且無干擾的[M-H-44]-和[FSO3]-為定量離子,優(yōu)化后的去簇電壓、碰撞能量等質譜參數見1.2.2節(jié)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

PFCs既有疏水性,又有親水性,多采用較低硅羥基活性填料的C18反相色譜柱實現分離。試驗分別考察了Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Thermo Hypersil Gold色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)、 Acquity Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)對15種PFCs分離效果的影響。結果表明,在相同梯度洗脫程序下,PFBA在Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱上有較好的保留,且其余目標物的分離效果較佳。因PFCs具有羧酸或磺酸官能團,具有一定極性,在流動相中加入適量乙酸銨可提高目標物的離子化效率,減少溶劑效應,改善峰形。

選用Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱作為分析柱,考察了PFCs在2,5,10 mmol·L-1乙酸銨溶液中的分離及響應情況。結果表明：隨著乙酸銨溶液濃度的增加,PFCs在色譜柱上的保留增強,出峰時間延遲,但組分間分離度無顯著變化;乙酸銨溶液濃度對磺酸型PFCs的響應值影響不顯著,而羧酸型PFCs的響應值隨著乙酸銨溶液濃度的增加有所下降。因此,試驗采用2 mmol·L-1乙酸銨溶液進行梯度洗脫。

在優(yōu)化的色譜、質譜條件下,15種PFCs混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖1。

1-PFBA;2-PFPeA;3-PFBS;4-PFHxA;5-PFHpA;6-PFHxS;7-PFOA;8-PFHpS;9-PFNA;10-PFOS;11-PFDA;12-PFUnDA;13-PFDoDA;14-PFTrDA;15-PFTeDA圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

試驗選擇穿透力強、蛋白沉淀效果好的乙腈作為有機提取溶劑,考察了體積分數分別為70%,80%,90%的乙腈溶液對目標物回收率的影響。結果表明,15種目標物回收率分別為76.5%～119%,78.0%～111%,75.3%～108%均在痕量分析合理的回收率范圍內,但是加水量過多,蛋白沉淀效果變差,提取液中水溶性成分含量增加,基質效應增強,影響后續(xù)的凈化效果,延長凈化液的氮吹時間。因此,試驗選擇以80%乙腈溶液提取目標物。

2.4 凈化柱的優(yōu)化

雞蛋基質復雜,含有大量蛋白質、卵黃素、膽固醇等內源性物質,需要選擇合適的凈化方法來降低基質干擾。濾過型Captive EMR-Lipid柱可利用排阻和疏水相互作用機制高效去除雞蛋樣品中脂質等基質。通過低、中、高等3個濃度水平的基質加標回收試驗,樣品提取液經濾過式Captive EMR-Lipid柱凈化后,15種目標物的回收率為78.0%～111%,而采用堿性離子對試劑提取,WAX柱凈化后,PFTrDA、PFTeDA等長鏈PFCs的回收率均小于50.0%,且凈化過程中易出現WAX柱堵塞的現象。因此,試驗選擇以濾過型Captive EMR-Lipid柱凈化,從而減少傳統(tǒng)固相萃取柱活化、淋洗等步驟,操作更加簡單、快速,并且長碳鏈PFCs的回收率得到了顯著改善。

2.5 基質效應

食品中的內源性成分及樣品前處理過程中的外源性成分會影響目標物的離子化效率,由此可能產生基質效應(ME)。根據(1-目標物在雞蛋基質提取液中的峰面積/目標物在溶劑甲醇中的峰面積)×100%計算ME值。當ME絕對值為0～20.0%時,表明基質效應在可接受范圍內;當ME絕對值為20.0%～50.0%時,表明存在弱基質效應;當ME絕對值大于50.0%時,表明存在強基質效應。15種PFCs的ME值見表3。

表3 基質效應

由表3可知：使用濾過型Captive EMR-Lipid柱凈化后,15種目標物的ME絕對值均不大于50.0%,絕大部分目標物的基質效應在可接受范圍內,但PFHxA、PFNA、PFOS的ME絕對值為20.0%～50.0%,表明存在弱基質效應。因此,試驗選擇采用同位素內標法進行定量,以降低基質效應對PFCs的影響,提高定量結果的準確度。

2.6 標準曲線和測定下限

用甲醇將15種PFCs混合標準溶液逐級稀釋成質量濃度為0,0.125,0.250,0.500,1.00,2.00,4.00,8.00,12.0,16.0,20.0 μg·L-1的混合標準溶液系列,同時加入適量的同位素混合內標溶液,使內標質量濃度均為2.00 μg·L-1,按照儀器工作條件進行測定。以目標物質量濃度為橫坐標,目標物和內標峰面積比值為縱坐標進行線性回歸。結果表明,15種PFCs標準曲線的線性范圍均為0.125～20.0 μg·L-1,線性回歸方程及相關系數見表4。

表4 線性回歸方程、相關系數和測定下限

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),結果見表4。

目前,我國發(fā)布的食品中PFCs檢測的相關標準主要包括GB 5009.253-2016《食品安全國家標準 動物源性食品中全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)的測定》、SN/T 3544-2013《出口食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸鹽的測定》、SN/T 4588-2016《出口蔬菜、水果中多種全氟烷基化合物測定 液相色譜-串聯質譜法》、SN/T 5222-2019《蜂蜜中20種全氟烷基化合物的測定 液相色譜-串聯質譜法》,標準方法的測定下限為0.01～1 μg·kg-1,與之相比,本方法測定下限為0.05～0.16 μg·kg-1,滿足痕量分析的基本要求。

2.7 精密度和回收試驗

在空白雞蛋樣品中加入一定量的混合標準溶液,使15種PFCs加標量為0.500,4.00,16.0 μg·kg-1,渦旋混勻,放置過夜,使樣品基質與目標物充分接觸,然后按照1.3節(jié)試驗方法進行處理及測定,每個加標濃度水平測定6份平行樣,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表5。

表5 精密度和回收試驗結果(n=6)

結果顯示,15種PFCs的回收率為78.0%～111%,測定值的RSD為0.87%～14%,回收率和精密度均滿足實際樣品的分析要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對10份市售雞蛋樣品進行檢測。結果顯示：有6份樣品檢出PFCs,檢出的PFCs有PFPeA、PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA、PFTeDA、PFOS,檢出量為0.045～0.670 μg·kg-1,且PFOA、PFOS的檢出率高達60%,其余PFBA、PFTrDA、PFBS、PFHxS、PFHpS均未檢出。

本工作提出了濾過型固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中15種PFCs含量的方法,該方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏等特點,為開展雞蛋中PFCs的檢測提供了方法參考。