去氫駱駝蓬堿誘發(fā)PC12細(xì)胞凋亡時(shí)對線粒體融合分裂的影響*

鞏月紅,趙美玲,馬瑞佳,林玉霞,趙軍,王建華

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,烏魯木齊 830054;2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830054;3.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院藥學(xué)部,烏魯木齊 830028)

去氫駱駝蓬堿(harmine,HM)是從我國西北干旱地區(qū)廣泛分布的蒺藜科駱駝蓬屬駱駝蓬種籽中提取獲得的一種三環(huán)β-咔啉類生物堿[1]。該化合物在抗腫瘤和抗包蟲病方面具有一定的應(yīng)用開發(fā)潛力,但因神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用使其未能進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用到臨床[2]。因此,突破HM神經(jīng)毒性的研究,闡明其神經(jīng)毒性損傷機(jī)制在目前的研究中至關(guān)重要。

目前,有研究發(fā)現(xiàn)HM可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。本課題組研究人員前期在研究中發(fā)現(xiàn)HM作用PC12細(xì)胞可能導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷,進(jìn)而激活細(xì)胞線粒體途徑的凋亡[4]。而線粒體是由一個(gè)不斷重組的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成,裂變和融合動(dòng)態(tài)平衡在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量、活性氧的產(chǎn)生以及程序性細(xì)胞死亡等基本功能中起重要作用[5]。正常生理狀態(tài)下,線粒體融合和分裂處于某種動(dòng)態(tài)平衡。一旦平衡打破,線粒體融合和分裂受阻,將會導(dǎo)致線粒體功能障礙、能量降低,進(jìn)而引發(fā)各種疾病產(chǎn)生[6]。其中,神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究已成為熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)外源化學(xué)物對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用常呈現(xiàn)一定的線粒體毒性作用,所引起的變應(yīng)性癥狀發(fā)展也常與線粒體功能障礙密切關(guān)聯(lián),因此,探討外源物質(zhì)的神經(jīng)毒性損傷作用也引起廣泛關(guān)注[7]。另有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡也受到線粒體分裂融合的嚴(yán)格調(diào)控,線粒體裂變依賴線粒體分裂蛋白Drp1影響線粒體能量合成的速度[8-10]。袁將等[11]研究表明,HM的神經(jīng)毒性與能量代謝異常相關(guān),變化的趨勢與給藥時(shí)間呈正相關(guān)。因此,筆者在本文擬觀察HM對PC12細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體形態(tài)、活性氧(ROS)等影響,從細(xì)胞水平上探討HM是否引起PC12細(xì)胞線粒體融合分裂異常,為進(jìn)一步深入研究HM毒理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 PC12人源神經(jīng)母瘤細(xì)胞株由新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同中心提供。

1.1.2藥物與試藥 HM(新疆華世丹藥業(yè)有限公司,批號:20210909,純度:97.69%),以二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成5 mmol·L-1的母液備用。Mdivi-1(美國MCE公司);WY14643(中國Selleck公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Gibco公司);胰酶、青霉素-鏈霉素混合液、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco'smodified Eagle's medium,DMEM)均由美國Hyclone公司提供;兔抗小鼠Bax單克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗小鼠Drp1單克隆抗體(美國Proteintech公司);兔抗小鼠Mfn2、兔抗小鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體均由美國CellSignaling Technology公司提供;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、Alex Flour?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司);噻唑藍(lán)(MTT試劑)(貨號:298-93-1)、JC-1試劑盒(批號:061319190830)、三磷酸腺苷(ATP)試劑盒(批號:061319190830)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(批號:20181122),上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器 Western blotting凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);SW-CJ-IFD型超凈操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Varioskan Flash型酶標(biāo)儀、二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存PC12細(xì)胞置37 ℃水浴5 min,使用DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS,1%青鏈霉素混合液)懸浮細(xì)胞,112×g離心5 min,接種于培養(yǎng)瓶中,置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇培養(yǎng),待細(xì)胞密度增加到約80%時(shí),胰蛋白酶-EDTA消化、離心、重懸細(xì)胞,以適宜密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率 將PC12細(xì)胞以每孔1×104接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)置空白對照組、HM組、線粒體分裂抑制劑Mdivi-1組、HM聯(lián)合Mdivi-1組(1：1),WY14643組和HM+WY14643組(1：1)。根據(jù)MTT試劑說明書,每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h,棄去上清液,磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗3次,每孔加入DMSO 100 μL,37 ℃振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度值(A490),計(jì)算細(xì)胞存活率及各化合物半數(shù)有效濃度(EC50)。細(xì)胞存活率(%)=(藥物處理組A490-空白孔A490)/(細(xì)胞對照組A490-空白孔A490)×100%。

1.4細(xì)胞分組 將PC12細(xì)胞以每孔1×104的密度接種在96孔板中,隨機(jī)分為細(xì)胞對照組、HM組、Mdivi-1組和HM+Mdivi-1組(1：1),按照MTT預(yù)實(shí)驗(yàn)24 h的EC50,取各組藥物濃度均為20 μmol·L-1,作用24 h。

1.5顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞存活率,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6JC-1熒光法檢測PC12細(xì)胞線粒體膜電位 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,根據(jù)JC-1試劑盒說明書,每孔加入JC-1工作液500 μL,混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱避光染色20 min。JC-1染色緩沖液潤洗3次,每次3 min,于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7Mito Tracker探針染色觀察PC12線粒體形態(tài)和縱橫軸長度比值 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,棄上清,無血清培養(yǎng)基潤洗1次,4%多聚甲醛于37 ℃固定15 min,無血清培養(yǎng)基潤洗3次,每孔加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋的MitoTracker Red探針,對線粒體進(jìn)行標(biāo)記,濃度為180 μmol·L-1,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)染色30 min。激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)和發(fā)射波長分別為579 nm/599 nm)下觀察各組細(xì)胞線粒體形態(tài),攝像并保存。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3個(gè),每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取細(xì)胞45～60個(gè),Image軟件分析每個(gè)細(xì)胞中線粒體的縱橫軸長度比值?？v橫軸長度比值=線粒體縱軸長度/線粒體橫軸長度;線粒體縱軸長度/線粒體橫軸長度比值越接近1,代表線粒體越趨向圓形;二者的值越大表示線粒體的形態(tài)越伸展,呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀[12]。

1.8PC12細(xì)胞ROS水平的檢測 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將DCFH-DA液稀釋,比例為1：1 000;每組加入0.5 mL,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。無血清細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌3次,去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.9PC12細(xì)胞ATP水平的檢測 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,收集細(xì)胞上清液,于細(xì)胞板孔中加入ATP裂解液100 μL,充分裂解并轉(zhuǎn)移至EP管,4 ℃、12 700×g離心10 min,吸取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測,將各組蛋白終濃度調(diào)整至相同。按照ATP檢測試劑盒說明書,檢測ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的發(fā)光值,根據(jù)ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品的ATP濃度。

1.10PC12細(xì)胞LDH釋放的檢測 取“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,棄上清液,加入LDH釋放試劑(體積比PBS:LDH=10：1)150 μL,混勻,置37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心,1 560×g、5 min。分別吸取各孔上清液120 μL,加入另一新96孔板相對應(yīng)板孔中,隨即進(jìn)行樣品測定。按照LDH檢測試劑盒說明書,檢測LDH標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的A值,根據(jù)LDH濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品的LDH濃度。

1.11Western blotting法檢測PC12細(xì)胞促凋亡蛋白Bax、cyt-c、Drp-1、Mfn2蛋白的表達(dá) 收集“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,采用RIPA裂解、超聲5 min、離心、取上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測,將各組細(xì)胞蛋白終濃度調(diào)整至相同,100 ℃沸水浴變性后備用。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(100 g·L-1)凝膠板,待凝固后將變性蛋白依序加至凝膠孔中,電泳分離,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉2 h,加入一抗:Drp1(1：2 000)、Mfn2(1：1 500)、Bax(1：1 000)、cyt-c(1：2 000)和β肌動(dòng)蛋白(β-actin,1：1 000),4 ℃孵育過夜;次日,TBST洗膜3次,加入稀釋度為1：1000二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG),放置暗處孵育2 h,TBST洗滌3次后,滴加電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)曝光液顯影。采用Image J 軟件對圖片進(jìn)行分析獲取蛋白條帶的積分吸光度值,以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值反映目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.12免疫熒光染色法檢測PC12細(xì)胞胱天蛋白酶3、Drp-1、Mfn2蛋白表達(dá) 收集“1.4節(jié)”分組處理的細(xì)胞,棄上清,PBS洗滌,加入40 g·L-1多聚甲醛作用30 min(固定細(xì)胞),PBS洗滌后用0.3%TritonX-100溶液通透10 min,0.5%BSA室溫下封閉1 h,加入以下抗體:胱天蛋白酶3(1：1 000)、Drp1(1：1 000)、Mfn2(1：1 000),4 ℃孵育過夜,棄上清,PBS洗滌3次,加入二抗:Alex Fluor488(綠色)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)室溫避光孵育1 h,PBS洗滌3次,用DAPI封固,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.13SiRNA干擾及電轉(zhuǎn)染效率檢測 SiRNA-NC和Drp1-siRNA-1203、-1523和-2154干擾組(綠色熒光修飾標(biāo)記)由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)和提供。siRNA的序列如表1所示。采用電穿孔法轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)1 d,將細(xì)胞密度為1×105加入到電穿孔緩沖液(200 μL)中。然后,加入siRNA-NC和Drp1-siRNA-1203、-1523和-2154干擾組,最終濃度為5 mmol·L-1。在125 V電擊10 ms后,將沖擊杯快速置于37 ℃培養(yǎng)箱中,放置10 min。收集PC12細(xì)胞,從不同組PC12細(xì)胞中分離出總RNA。采用RT-qPCR檢測Drp1、Mfn2的表達(dá)水平,評價(jià)轉(zhuǎn)染效率。

表1 引物序列

選擇從上述方法中獲得的最佳siRNA序列用于PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分為4組:空白對照組、siRNA-NC、HM組、HM+siRNA-1523組。轉(zhuǎn)染1 h后,每組收集PC12細(xì)胞1×105個(gè),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌,置于載玻片上。采用倒置熒光顯微鏡獲取熒光圖像,觀察各組的綠色熒光強(qiáng)度。采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞存活率,Western blotting檢測Drp1、Mfn2的表達(dá)水平。見表1。

1.14統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HM對PC12細(xì)胞存活率的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示,與細(xì)胞對照組比較,HM組、Mdivi-1組、HM+Mdivi-1組、WY14643組、HM+WY14643組細(xì)胞存活率均顯著降低(F=39.446～23 214.593,607.221～7 571.304,48.091～4 445.214,33.459～12 225.810,4.416～12 012.643,均P<0.01);與HM組比較,HM+Mdivi-1組、HM+WY14643組細(xì)胞存活率顯著降低(F=363.717,P<0.01),見圖1。各組藥物對PC12細(xì)胞24 h的EC50分別為(27.08±1.06)、(31.73±1.09)、(31.95±1.76)、(21.69±3.07)、(25.96±1.88)μmol·L-1。因此,參考各組藥物細(xì)胞存活率變化趨勢、EC50值及藥物作用性質(zhì),后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 μmol·L-1濃度的HM、Mdivi-1和HM+Mdivi-1作為構(gòu)建PC12細(xì)胞模型的工作濃度,該濃度對PC12細(xì)胞存活率結(jié)果見表2。

①與0 μmol·L-1比較,P<0.01。

表2 去氫駱駝蓬堿對PC12細(xì)胞存活率的影響

2.2HM對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果見圖2。細(xì)胞對照組PC12細(xì)胞在靜息狀態(tài)下生長良好,呈長梭形或多角型,且有圓形或橢圓形增殖細(xì)胞,細(xì)胞透亮折光性較強(qiáng),樹枝狀突起延伸將細(xì)胞連接形成網(wǎng)絡(luò)狀;HM組、Mdivi-1組PC12細(xì)胞貼壁功能呈不同程度下降,部分細(xì)胞開始脫落、形成聚集,細(xì)胞密度下降、折光性下降,細(xì)胞突起減少或消失;HM+Mdivi-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為細(xì)胞明顯圓縮、突起消失,大部分細(xì)胞脫落。

箭頭表示細(xì)胞突起減少或消失。

2.3HM對PC12線粒體形態(tài)和縱橫軸長度比值的影響 圖3結(jié)果顯示,激光共聚焦顯微鏡觀察,細(xì)胞對照組細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)正常,線粒體主要呈長桿狀結(jié)構(gòu),散布于胞質(zhì)。HM組、Mdivi-1干預(yù)后線粒體出現(xiàn)碎片化結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)細(xì)小點(diǎn)狀、短桿狀。給予HM+Mdivi-1處理的PC12細(xì)胞內(nèi)片段化線粒體減少。與細(xì)胞對照組比較,HM、Mdivi-1組干預(yù)后線粒體縱橫軸比值降低(F=58.539,25.907,均P<0.01)。與細(xì)胞對照組比較,HM+Mdivi-1處理的PC12細(xì)胞內(nèi)片段化線粒體的縱橫軸比值趨向1(F=190.388,P<0.01),提示線粒體斷裂的程度嚴(yán)重,形態(tài)趨向圓形。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01。

2.4HM對PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響 JC-1檢測結(jié)果見圖4。與細(xì)胞對照組比較,HM組、Mdivi-1組、HM+Mdivi-1組給藥后PC12細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同程度降低,而綠色熒光強(qiáng)度增均顯著增強(qiáng)。圖4是對上述熒光結(jié)果中紅色與綠色熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行數(shù)字化,繪制得到柱狀圖。從定量圖中可更清晰直觀地看出ΔΨm的變化趨勢,表現(xiàn)為HM組、Mdivi-1組、HM+Mdivi-1組紅/綠熒光強(qiáng)度比值與細(xì)胞對照組相比均顯著降低(F=364.357,98.143,538.163,P<0.01),HM+Mdivi-1組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度比值(紅色/綠色熒光)較HM組顯著降低(F=1 169.711,P<0.01)。說明HM、Mdivi-1、HM+Mdivi-1對PC12細(xì)胞的ΔΨm有一定的損傷作用。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01;②與HM組比較,P<0.01。

2.5HM及其衍生物對PC12細(xì)胞中ROS活性氧水平的影響 如圖5所示,DCF標(biāo)記線粒體ROS(呈綠色熒光),HM組、HM+Mdivi-1組均可見不同程度的綠色熒光,Mdivi-1熒光不明顯。與細(xì)胞對照組比較,HM組、HM+Mdivi-1組熒光強(qiáng)度顯著(F=149.793,356.348,P<0.01),Mdivi-1組結(jié)果不顯著(P>0.05)(圖5)。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01。

2.6HM對PC12細(xì)胞ATP合成和LDH釋放的影響 結(jié)果見表3。與細(xì)胞對照組比較,HM組、Mdivi-1組、HM+Mdivi-1組細(xì)胞線粒體ATP水平均顯著降低(F=24.055,27.938,51.422,均P<0.01);與HM組比較,HM+Mdivi-1組ATP水平顯著降低(F=12.486,P<0.05)。與細(xì)胞對照組比較,HM、HM+Mdivi-1組LDH釋放均顯著升高(F=372.815,1 050.327,均P<0.01),Mdivi-1組LDH釋放量顯著低于HM組(F=65 995.895,P<0.01)。

表3 去氫駱駝蓬堿對PC12細(xì)胞ATP和LDH水平的影響

2.7HM對PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果見圖6。與細(xì)胞對照組比較,HM組、Mdivi-1組、HM+Mdivi-1組胱天蛋白酶3表達(dá)水平均顯著上升(F=262.236,23.739,316.501,均P<0.01),Mdivi-1組胱天蛋白酶3表達(dá)水平相較HM組、HM+Mdivi-1組低,但結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01。

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。與細(xì)胞對照組比較,HM組細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平及細(xì)胞素色C(cyt-c)表達(dá)水平均顯著上升(F=27.233,50.298,P<0.01)。與HM組比較,Mdivi-1組Bax表達(dá)上調(diào)、cyt-c表達(dá)下調(diào)(F=229.392,24.160,P<0.05)。與細(xì)胞對照組、HM組和Mdivi-1組比較,HM+Mdivi-1組Bax、cyt-c表達(dá)顯著上升(F=1316.781,831.014,P<0.01)。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01;②與細(xì)胞對照組比較,P<0.05;③與HM組比較,P<0.05。

2.8HM對PC12細(xì)胞線粒體融合分裂蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果見圖8。與細(xì)胞對照組比較,HM組、HM+Mdivi-1組線粒體分裂蛋白Drp1的表達(dá)顯著上升(F=804.213,126.566,P<0.01),Mdivi-1組表達(dá)顯著下降(F=42.185,P<0.01);而線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá),與細(xì)胞對照組比較,HM組、HM+Mdivi-1組表達(dá)顯著下降(F=37.599,8.811,P<0.01),Mdivi-1組表達(dá)顯著上升(F=19.041,P<0.01)。Western blotting結(jié)果顯示,與細(xì)胞對照組比較,HM組、HM+Mdivi-1組線粒體分裂蛋白Drp1的表達(dá)水平顯著上升(F=203.007,179.179,P<0.01),Mdivi-1組表達(dá)下降(F=27.899,P<0.05),而HM組、HM+Mdivi-1組線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)水平顯著降低(F=75 942.840,1 927.072,P<0.01),Mdivi-1組表達(dá)顯著上升(F=233.647,P<0.05)。結(jié)果可說明HM、可以影響線粒體融合、分裂蛋白表達(dá)。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01;②與細(xì)胞對照組比較,P<0.05。

2.9電轉(zhuǎn)染率分析 對照組和siRNA-NC組Drp1表達(dá)水平分別為(1.22±0.72)和(1.27±0.51),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖9。經(jīng)HM處理后,Drp1的表達(dá)較對照組顯著增加,為(6.26±0.62)(F=1023.969,P<0.01)。與HM組比較,Drp1-siRNA-1203、-1523和-2154的Drp1表達(dá)均下調(diào),而Drp1-siRNA-1523組Drp1表達(dá)(3.29±0.39)顯著低于HM組(F=175.660,P<0.01),見圖9。將Drp1-siRNA-1523導(dǎo)入PC12細(xì)胞,觀察其熒光強(qiáng)度。對照組PC12細(xì)胞中沒有綠色熒光點(diǎn),而Drp1-siRNA-1523和siRNA-NC組的PC12細(xì)胞顯示明亮的綠色熒光點(diǎn),見圖9B。根據(jù)這些結(jié)果,在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇Drp1-siRNA-1523作為Drp1干擾。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01;②與HM組比較,P<0.01。

2.10篩選的干擾序列轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后活性檢測 細(xì)胞對照組PC12細(xì)胞存活率(100.98±0.75)與siRNA-NC組(97.52±0.60)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與細(xì)胞對照組比較,HM組存活率(54.63±1.33)顯著降低(F=9 581.333,P<0.01)。HM+Drp1-siRNA-1523組存活率為(36.45±1.11)。表明當(dāng)HM+Drp1-siRNA-1523組干擾與HM處理聯(lián)合使用時(shí)PC12細(xì)胞的存活率比單獨(dú)使用HM處理的低(F=878.960,P<0.01)。此外,這些數(shù)據(jù)表明Drp1基因敲除降低了PC12細(xì)胞對HM的耐受。

2.11免疫印跡法檢測篩選的干擾序列轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后Drp1、Mfn2的表達(dá)水平 細(xì)胞對照組和siRNA-NC組各基因的表達(dá)水平均無顯著差異,見圖10。與細(xì)胞對照組比較,HM組Drp1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(F=2 777.623,P<0.01)、Mfn2的表達(dá)下調(diào)(F=4 038.317,P<0.01);而Drp1基因敲除后,與僅接受HM的干預(yù)組比較,Drp1和Mfn2的表達(dá)明顯下調(diào)(F=73.396,377.354,P<0.01)。

①與細(xì)胞對照組比較,P<0.01;②與HM組比較,P<0.01。

3 討論

目前研究表明HM具有良好的抗包蟲作用,與包蟲病臨床應(yīng)用藥物阿苯達(dá)唑相比肝毒性小、抗蟲活性高,但因其中樞神經(jīng)毒性作用,臨床應(yīng)用受限。因此,明確HM神經(jīng)毒性作用機(jī)制對該藥對包蟲病的治療至關(guān)重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HM可激活細(xì)胞線粒體途徑的凋亡[4]。且有研究報(bào)道HM的神經(jīng)毒性與能量代謝異常相關(guān)[11]。現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明,HM可能通過線粒體途徑凋亡抑制細(xì)胞生長,并誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。為了進(jìn)一步確證HM的毒性作用是否與線粒體途徑的凋亡有關(guān),課題組首先通過考察HM作用細(xì)胞后對細(xì)胞線粒體表型、功能影響的研究,發(fā)現(xiàn)HM通過ROS的累積,誘導(dǎo)增加了線粒體膜的通透性,降低線粒體的膜電位、增強(qiáng)了線粒體的片段化及使ATP生成量減少,激活了caspase-3凋亡途徑使PC12細(xì)胞凋亡,可見HM作用PC12細(xì)胞可能啟動(dòng)了線粒體途徑的細(xì)胞凋亡,凋亡的過程中伴隨著能量代謝功能障礙。

當(dāng)線粒體融合分裂平衡異常發(fā)生時(shí)也將導(dǎo)致線粒體功能障礙,表現(xiàn)為ATP生成量減少、ROS產(chǎn)生增多[13]。由此,推測HM促細(xì)胞凋亡過程中可能引起線粒體融合分裂失衡,研究結(jié)果表明HM作用PC12細(xì)胞可使細(xì)胞分裂、融合蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著變化,明顯上調(diào)細(xì)胞Drp1蛋白表達(dá)水平,下調(diào)了細(xì)胞Mfn2蛋白表達(dá)水平,該結(jié)果在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中結(jié)果得到映證,且已有報(bào)道稱Drp1相關(guān)的線粒體分裂過度可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[14]。故推測HM可能通過促進(jìn)線粒體分裂增加,加速了PC12細(xì)胞凋亡。因此,選用Mdivi-1(一種選擇性的線粒體裂變抑制劑)測試抑制線粒體裂變是否會對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響,結(jié)果表明Mdivi-1卻加劇HM引起的線粒體分裂促進(jìn),表現(xiàn)為Drp1水平升高。推測Mdivi-1與HM聯(lián)合可進(jìn)一步增強(qiáng)了線粒體功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞活力明顯下降。siRNA干擾在抑制內(nèi)源性Drp1后,能夠顯著抑制線粒體分裂,加強(qiáng)線粒體動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)平衡[15]。為此,又在PC12細(xì)胞中成功敲除Drp1后,使用MTT和蛋白免疫印跡的方法研究了細(xì)胞存活率以及Drp1、Mfn2的蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)HM組相比,siRNA-Drp1聯(lián)合HM進(jìn)一步下調(diào)Drp1、Mfn2的表達(dá),表明下調(diào)Drp1聯(lián)合HM作用可能通過線粒體融合分裂失衡增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說明僅調(diào)節(jié)線粒體裂變(刺激或抑制)不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活性,而會促進(jìn)HM誘導(dǎo)的線粒體動(dòng)態(tài)、形態(tài)和功能損傷,從而降低神經(jīng)元存活率,導(dǎo)致細(xì)胞過度凋亡。

最終研究表明在HM作用PC12細(xì)胞過程中通過干擾線粒體融合分裂實(shí)現(xiàn)削弱代償性能量合成過程,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。遺憾的是研究對于干擾線粒體融合分裂的具體作用模式?jīng)]有涉及,仍需通過功能增益和功能喪失等研究進(jìn)一步深入研究。但本次研究所發(fā)現(xiàn)的HM誘導(dǎo)線粒體分裂的機(jī)制對探明HM的藥理作用具有非常重要的參考價(jià)值,也為進(jìn)一步利用HM的神經(jīng)毒性作用可上調(diào)線粒體分裂機(jī)制治療包蟲病提供新的理論依據(jù)。