生物色譜法在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

文星星，沈 萍，張 濤，李詩(shī)卉，申 童，譚勝國(guó)

湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，412000

中藥研究非常關(guān)注中藥的效應(yīng)與物質(zhì)基礎(chǔ)，這也是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前，通過(guò)應(yīng)用高效液相色譜、紫外和紅外光譜及質(zhì)譜等現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)，我們能夠分離并分析中藥中的各種成分。同時(shí)，結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們可以深入研究中藥中的活性成分，以進(jìn)一步揭示中藥的作用機(jī)制，這也是目前研究中藥活性成分的基本方法。然而，獲取可用于常規(guī)藥理效應(yīng)研究的化合物并不容易。因此，引入生物色譜法，即將色譜分離與分子生物技術(shù)相結(jié)合，為中藥活性成分的篩選、分離分析及其作用機(jī)理的研究提供了新的思路與方法，尤其對(duì)中藥活性成分的篩選具有重要意義，為中藥現(xiàn)代化進(jìn)程提供了強(qiáng)有力的支持[1]。

1 基本原理和分類

1.1 生物色譜法基本原理

生物色譜法是基于生命科學(xué)和色譜技術(shù)交叉融合的一種新技術(shù)，出現(xiàn)于20 世紀(jì)80年代中后期。該技術(shù)采用活性生物大分子、生物膜或仿生生物膜、活細(xì)胞作為生物活性填料，并將其固定在液相色譜載體上，用于分離和分析藥物活性成分。這種系統(tǒng)可以模擬藥物中的活性成分與生物大分子、靶標(biāo)或細(xì)胞之間的相互作用，可以應(yīng)用于活性成分的篩選與分離及藥物中活性成分作用機(jī)制的研究。生物色譜法具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出光明的發(fā)展前景。

1.2 生物色譜法分類

根據(jù)固定相的不同，生物色譜法可分為分子生物色譜法、生物膜或仿生生物膜色譜法和細(xì)胞生物色譜法等類別。其核心技術(shù)為將活性生物大分子或脂筏、生物膜或仿生生物膜、活細(xì)胞等作為生物活性填料，并使其與色譜載體結(jié)合作為固定相[1-2]。

2 在中藥研究中的應(yīng)用

2.1 分子生物色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

分子生物色譜法是基于生物大分子特異性識(shí)別原理的一種生物色譜技術(shù)，主要用于分離和分析中藥及其復(fù)方中具有活性的化合物。該技術(shù)將酶、受體、DNA 及血漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等作為配基來(lái)研究藥物活性成分與配基之間的相互作用。自20 世紀(jì)90年代初起，分子生物色譜法就開(kāi)始被應(yīng)用于藥物活性成分與生物大分子之間相互作用的研究。其中，常見(jiàn)的生物大分子包括血漿蛋白、人血清白蛋白、α1-酸性糖蛋白、酶和黑色素等[3]。在技術(shù)發(fā)展方面，分子生物色譜法與核磁共振技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等相結(jié)合建立了一體化系統(tǒng)，可以提供結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)活性成分的篩選、分離分析與結(jié)構(gòu)鑒定的一體化。

分子生物色譜法是一種高效且具有強(qiáng)特異性的分離篩選方法，在中藥活性成分的篩選中得到了廣泛應(yīng)用。王序等[4]從現(xiàn)代分子生物學(xué)出發(fā)，首次全面探索了分子生物色譜技術(shù)在中藥活性成分研究中的應(yīng)用。其采用多種酶和受體、補(bǔ)體系統(tǒng)等對(duì)常用的150 種中藥中的400 多種提取物進(jìn)行了生物活性篩選，找到了許多新的模式化合物，不僅為中藥作用機(jī)理的研究提供了新思路，也推動(dòng)了中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。隨后，孔亮等[5]以人血清蛋白等大分子為固定相構(gòu)建了分子生物色譜體系，對(duì)當(dāng)歸、川芎等中藥中的活性成分進(jìn)行了篩選，并建立了對(duì)當(dāng)歸中的阿魏酸和藁本內(nèi)酯的定量分析方法，推動(dòng)了分子生物色譜技術(shù)的發(fā)展。潘再法等[6]以牛血清蛋白作為固定相構(gòu)建了生物色譜體系，進(jìn)一步研究了當(dāng)歸中的活性成分。尚叢珊[7]等建立了β2-AR 色譜模型，并應(yīng)用該模型初步驗(yàn)證了黃芩等藥物中的活性成分，發(fā)現(xiàn)黃芩等中藥中含有能夠與β2-AR 發(fā)生作用的活性成分，從而論證了受體作為固定相在中藥活性成分篩選中的作用。此外，利用脂筏，即細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的特殊脂質(zhì)或蛋白區(qū)域作為固定相配基的脂筏色譜也成為了研究熱點(diǎn)，尤其是多靶標(biāo)的脂筏色譜在抗腫瘤藥物活性成分篩選中得到了廣泛應(yīng)用。余江南教授組的屈睿博士構(gòu)建了多靶點(diǎn)的脂筏親和色譜，并對(duì)北葶藶子中的抗腫瘤活性部分進(jìn)行了提取分離，分析了其抗腫瘤活性和作用機(jī)理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)中藥中活性成分的多靶點(diǎn)高效分析[8]。

2.2 生物膜色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

生物膜色譜法是指以活性細(xì)胞膜為固定相的生物色譜技術(shù)。目前，常用的細(xì)胞種類包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、胰島β-細(xì)胞等，具有特異性、多靶標(biāo)性、將分離和篩選相結(jié)合及適用于大規(guī)模藥物篩選的特點(diǎn)，對(duì)中藥研究具有重要意義。

賀浪沖教授首次提出了細(xì)胞膜色譜的理念，他用吸附法將活性細(xì)胞膜固定在硅膠表面，同時(shí)結(jié)合其色譜特性引入了細(xì)胞膜生物色譜法[9]，并將其廣泛應(yīng)用于中藥研究。其課題組的趙惠如等[10]采用細(xì)胞膜色譜技術(shù)對(duì)當(dāng)歸中的有效成分進(jìn)行了篩選，并結(jié)合薄層色譜法分離，通過(guò)離體藥理實(shí)驗(yàn)證明了這些成分能夠?qū)ρ芗?xì)胞膜及膜受體發(fā)揮作用。趙小娟等[11]利用細(xì)胞膜色譜法確定了淫羊藿根中能夠與血管細(xì)胞膜及膜受體相互作用的活性成分，并進(jìn)一步與淫羊藿葉進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種活性成分在淫羊藿的葉部并不存在，為淫羊藿根的開(kāi)發(fā)利用和定性定量分析提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這些研究表明細(xì)胞膜色譜法在中藥研究中具有重要作用。

此外，利用脂質(zhì)體等結(jié)構(gòu)模擬生物膜結(jié)構(gòu)的仿生生物膜色譜技術(shù)也廣泛應(yīng)用于酶、蛋白質(zhì)等活性成分的分離。董倩倩等[12]將仿生物膜色譜技術(shù)與質(zhì)譜等技術(shù)聯(lián)用對(duì)丹參水提液中的活性成分進(jìn)行了分析和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參水提液中有8 個(gè)成分與模擬生物膜存在明顯的相互作用。柴心怡[13]建立了基于膜受體的NKG2A 整體柱生物色譜分析新方法，并利用陽(yáng)性藥和陰性藥對(duì)該方法的有效性進(jìn)行了考察，結(jié)果證明NKG2A-脂質(zhì)體-整體柱上的NKG2A受體具有特異性識(shí)別配體的活性，柱有效性符合要求，并篩選出黃酮類化合物中的主要活性成分為黃芩苷和漢黃芩苷，為膜受體靶向藥物的精準(zhǔn)篩選提供了全新的思路和技術(shù)。此外，有報(bào)道表明，將仿生物膜色譜法與其他生物色譜技術(shù)結(jié)合在中藥研究中也發(fā)揮了重要的作用[14]。

2.3 細(xì)胞生物色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

細(xì)胞生物色譜法是采用人或動(dòng)物的活細(xì)胞、植物的細(xì)胞或細(xì)胞壁為固定相，利用動(dòng)物活細(xì)胞的特異性結(jié)合能力或植物細(xì)胞中細(xì)胞壁的選擇通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離與富集的一種生物色譜技術(shù)。

吳祥瑞等[15]以肝細(xì)胞為固定相構(gòu)建了細(xì)胞生物色譜系統(tǒng)，通過(guò)篩選中藥中作用多靶點(diǎn)的活性成分對(duì)茵陳蒿湯中的活性成分進(jìn)行篩選，通過(guò)分離和提取得到了其中能夠與肝細(xì)胞特異性結(jié)合的活性成分，并確認(rèn)了其保肝效應(yīng)，初步探索了其作用機(jī)理。洪敏等[16]建立了肝細(xì)胞固相萃取高效液相色譜分析模型，并采用該模型對(duì)梔子中的保肝活性成分進(jìn)行篩選分析，成功篩選出其中的活性成分——梔子苷，該成分已被證實(shí)對(duì)多種肝損傷具有良好的保護(hù)作用，是梔子中的主要有效成分。這證實(shí)了通過(guò)該方法篩選得到的保留成分與其藥效之間具有顯著相關(guān)性，可用于中藥這種復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)的分析研究。

3 總結(jié)與展望

生物色譜法是一種用于分離和分析活性成分的技術(shù)，具有特異性高、多靶標(biāo)、篩選過(guò)程快速簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)。它在中藥活性成分的篩選、分離與分析、指紋圖譜分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定等方面有著廣泛的應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)的分離和藥效篩選方法，生物色譜法能夠?qū)⒒钚猿煞值姆蛛x和篩選結(jié)合在一起，不僅減少了分離和藥效篩選的分離，還能消除無(wú)活性成分的干擾，縮小活性成分的篩選范圍。

然而，生物色譜技術(shù)在應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題。例如，生物色譜柱的壽命普遍較短且尚未實(shí)現(xiàn)商品化，尤其是用于特異性活性篩選的色譜柱，需要自己制備具有專一屬性的生物色譜柱。同時(shí)，在應(yīng)用過(guò)程中需要摸索其用于分離和分析的穩(wěn)定條件，這對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件及操作者的專業(yè)技術(shù)要求較高，因此對(duì)該技術(shù)進(jìn)行推廣和使用較為困難。此外，生物色譜技術(shù)僅應(yīng)用于體外研究，不能完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，因此不能代替對(duì)藥效成分在體內(nèi)的作用的研究。

未來(lái)，隨著技術(shù)問(wèn)題的解決和研究的深入，生物色譜技術(shù)在中藥領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化發(fā)展。此外，生物色譜技術(shù)在藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、藥物毒性和新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。