在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中FOXM1靶向調(diào)控NLRP3表達(dá)*

孫 甜,張振旺

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部醫(yī)藥研究院)

膿毒癥是一種宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào),導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙綜合癥,約45%～70%膿毒癥患者會(huì)發(fā)生急性腎損傷[1]。膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(sepsis-induced acute kidney injury,SA-AKI)預(yù)示著比單獨(dú)的任何一種綜合征都有更差的預(yù)后,并且與重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)時(shí)間、住院時(shí)間、長期殘疾率、致死率、人群生活質(zhì)量相關(guān)[2]。長期以來人們對(duì)于SA-AKI在診斷和指導(dǎo)治療的生物標(biāo)志物方面仍然缺乏描述[3],使得臨床上對(duì)SA-AKI患者缺乏切實(shí)有效的早期風(fēng)險(xiǎn)分層和治療監(jiān)測方案。

既往研究表明,NLRP3炎性小體的激活可促進(jìn)SA-AKI[4],且靶向NLRP3炎癥小體已被證明對(duì)急性腎損傷具有明確的治療作用,激活FOXM1通路可以促進(jìn)炎癥因子分泌[5],沉默F(xiàn)OXM1能夠降低糖尿病小鼠腎臟炎癥因子的表達(dá)[6],然而FOXM1能否通過靶向調(diào)控NLRP3表達(dá)而影響SA-AKI的發(fā)生發(fā)展尚無相關(guān)報(bào)道。因此,本文擬從免疫組化、免疫印跡、雙熒光素酶報(bào)告基因和qRT-PCR等途徑探討在LPS誘導(dǎo)的SA-AKI中炎性因子的表達(dá)變化及炎癥相關(guān)因子的可能調(diào)控機(jī)制,以期篩選出新的生物損傷標(biāo)志物,應(yīng)用于SA-AKI的早期診斷和疾病干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

10只SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010]。MPC5細(xì)胞由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院細(xì)胞系傳代而來。

1.1.2 主要試劑與儀器

LPS(脂多糖)和FOXM1單克隆抗體購自Beyotime公司;NLRP3和IL-1β單克隆抗體購自Affinity Biosciences公司;IL-6多克隆抗體、一抗稀釋液、二抗稀釋液和Dual-Lumi雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Servicebio公司;α-tubulin多克隆抗體購自Beyotime公司;組織裂解液(10×)購自Biosharp公司;RNA isolater購自Vazyme公司;ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR和2×Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal) 購自TOLOBIO公司;NeofectTMDNA transfection reagent購自北京碼因科技有限公司。

熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);NanoDrop 2000(中國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實(shí)施方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備

將10只C57小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(鄂)2018-0071]適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON,n=5)和LPS組(LPS,n=5)。LPS組小鼠按照10mg/kg體重一次性腹腔注射1mg/mL的LPS溶液;正常對(duì)照組注射等體積的生理鹽水,兩組小鼠均于給藥24h后取材。眼球取血用于ELISA檢測,4%多聚甲醛固定雙腎,左腎用于免疫組化染色,右腎用于免疫印跡檢測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用含10%FBS和抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基,將MPC5細(xì)胞培養(yǎng)在含5%CO2、恒溫37℃的條件下的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,換新鮮完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、pCMV-Vector組、pCMV-FOXM1(1μg)組、pCMV-FOXM1(2μg)組和空白對(duì)照組、SiCTL組、SiFOXM1(1μg)組、SiFOXM1(2μg)組。2h后將各組質(zhì)粒DNA加入100μL無血清DMEM,充分混勻后制成DNA稀釋液,再向其中直接加入2μL NeofectTMDNA transfection reagent,輕柔混勻,室溫靜置20min后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)36h收取細(xì)胞。

1.2.3 血清生化指標(biāo)

各組小鼠眼球取血,室溫自然凝固20min,2000rpm,15min(4℃條件下),收集上清液。采用全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技,Chemray 240)測定血清中尿酸(UA)、尿素(UREA)和肌酐(CREA)的含量。

1.2.4 免疫組化法染色

腎組織石蠟切片烤片脫蠟至水化,于3%H2O2溶液浸泡15min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,高壓抗原修復(fù),室溫封閉30min后分別加入IL-1β、IL-6和NLRP3一抗(1∶200)4℃孵育過夜,次日加入相應(yīng)種屬的二抗,室溫?fù)u床孵育1h,充分洗滌后DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察IL-1β、IL-6和NLRP3的免疫組化染色結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測

在10mg小鼠腎臟組織中加入300μL組織裂解液,研磨珠配平后于超速破碎儀充分研磨,所得組織勻漿液置冰上裂解30min,4℃,12 000rpm離心10min后,取上清液測BCA進(jìn)行蛋白定量,加入5×loading buffer充分混勻,于98℃煮沸7min行蛋白變性,10%SDS-PAGE電泳,250mA轉(zhuǎn)膜2h,5%脫脂牛奶封閉1h,4℃搖床過夜孵育一抗稀釋液FOXM1(1∶1000)、NLRP3(1∶1000)、IL-6(1∶1000)和α-tubulin(1∶1000)。次日1×TBST快搖洗膜3次,10min/次,于相應(yīng)種屬的二抗稀釋液(1∶1000)室溫孵育1h,再次快搖洗膜3次,10min/次,配制ECL發(fā)光顯影液顯影。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值,目的蛋白表達(dá)水平(%)=目的蛋白灰度值/α-tubulin灰度值×100%。

1.2.6 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXM1與NLRP3的靶向關(guān)系

利用HumanTFDB網(wǎng)站分析(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/)預(yù)測FOXM1與NLRP3的靶向結(jié)合情況。在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合成NLRP3啟動(dòng)子(1～2000bp)熒光素酶報(bào)告載體pNLRP3-pro-Luc。培養(yǎng)MPC5密度達(dá)到80%～90%后,將其以每孔1×105細(xì)胞傳代于12孔板培養(yǎng)24h,使用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測相關(guān)重組載體pNLRP3-pro-Luc(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)、pRL(renilla luciferase reporter vector)和pCMV-FOXM1(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)等質(zhì)粒,繼續(xù)培養(yǎng)48h后移除培養(yǎng)基,無菌0.01mmol/L的PBS洗滌1次。將雙熒光素酶檢測試劑盒中1×PLB(passive lysis buffer)裂解液分別以每孔200μL加入12孔板,劇烈搖動(dòng)20min。將裂解液收集于1.5mL離心管,于離心機(jī)12 000rpm離心30s,收取上清液待檢測。取雙熒光素酶試劑盒中LARII 10μL于1.5mL離心管。加入上述細(xì)胞裂解液10μL于離心管輕輕混勻,采用GLOMA檢測儀獲取數(shù)值A(chǔ)。取出1.5mL離心管再加入10μL Stop&Glo Reagent溶液,輕輕混勻,置于GLOMA檢測儀獲取數(shù)值B。計(jì)算樣本的A/B(每組重復(fù)3次)值即為熒光素酶相對(duì)表達(dá)量,代表基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

棄去培養(yǎng)基,用37℃無菌PBS洗滌2～3次,用RNA isolater提取各組MPC5 RNA,NanoDrop2000測定RNA總濃度,用ToloScript RT EasyMix for qPCR (with 2-Step gDNA Erase-Out)去除基因組DNA和逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal)進(jìn)行定量檢測,條件:95℃ 5min,95℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 30s,總共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參定量NLRP3和FOXM1表達(dá),采用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 UA、UREA和CREA在SA-AKI血清中的濃度

UA、UREA和CREA的產(chǎn)生增加是LPS誘導(dǎo)的SA-AKI小鼠模型的一個(gè)重要標(biāo)志[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組血清中UA、UREA和CREA的濃度明顯增加,見圖1。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=5。

2.2 IL-1β、IL-6和NLRP3在SA-AKI腎組織中表達(dá)情況

通過免疫組織化學(xué)染色法檢測LPS誘導(dǎo)的SA-AKI小鼠模型腎組織中IL-1β、IL-6和NLRP3的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組可見數(shù)量較多的胞質(zhì)、胞核呈大量棕黃色的陽性細(xì)胞,由此表明LPS組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6和NLRP3表達(dá)增加,見圖2。

圖2 免疫組化檢測LPS誘導(dǎo)的SA-AKI腎組織中IL-1β、IL-6和NLRP3的表達(dá)(標(biāo)尺:20μm)

A.免疫印跡檢測LPS誘導(dǎo)SA-AKI模型中IL-6和NLRP3表達(dá)水平變化;B.IL-6和NLRP3蛋白條帶灰度值分析(與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,n=5)。

2.3 IL-6和NLRP3在SA-AKI模型中表達(dá)情況

通過免疫印跡檢測LPS誘導(dǎo)的SA-AKI模型中腎組織炎癥因子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組小鼠腎臟組織中的IL-6和NLRP3表達(dá)水平上調(diào),與免疫組化檢測結(jié)果一致,見圖3。

2.4 FOXM1與NLRP3的靶向關(guān)系及結(jié)合位點(diǎn)

HumanTFDB網(wǎng)站分析顯示,FOXM1-NLRP3啟動(dòng)子區(qū)域通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合,且二者之間有“-219 to -227bp、-388 to -394bp、-396 to -402bp和 -462 to -470bp”4個(gè)結(jié)合位點(diǎn),見圖4。

圖4 FOXM1和NLRP3的靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.5 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1對(duì)NLRP3基因表達(dá)的影響

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高表達(dá)FOXM1后熒光活性升高,提示FOXM1靶向結(jié)合NLRP3啟動(dòng)子,說明轉(zhuǎn)錄因子FOXM1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控NLRP3基因表達(dá)(P<0.05),見圖5。

與對(duì)照組比較,**P<0.01,***P<0.001,n=3。

2.6 FOXM1在SA-AKI模型中表達(dá)情況

A.免疫印跡檢測Lps誘導(dǎo)的Sa-Aki模型中Foxm1表達(dá)水平的變化;B.Foxm1蛋白條帶灰度值分析(與對(duì)照組比較,***P<0.001,n=5)。

通過免疫印跡檢測LPS誘導(dǎo)的SA-AKI模型中FOXM1的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,FOXM1在LPS誘導(dǎo)的SA-AKI模型中高表達(dá),見圖6。

2.7 FOXM1對(duì)NLRP3基因表達(dá)的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,pCMV-FOXM1組在MPC5細(xì)胞中過表達(dá)FOXM1,NLRP3 mRNA水平隨之升高,且隨著濃度梯度的升高而升高。與空白對(duì)照組相比,SiFOXM1組在MPC5細(xì)胞中沉默F(xiàn)OXM1的表達(dá),FOXM1的表達(dá)明顯降低,同時(shí)NLRP3 mRNA水平也隨之降低,且隨著濃度梯度的降低而降低,表明FOXM1能調(diào)控NLRP3基因表達(dá),并呈現(xiàn)出濃度梯度依賴性,見圖7。

與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3。

3 討 論

根據(jù)急重癥質(zhì)量倡議(acute disease quality initiative,ADQI)提出膿毒癥診斷后7天內(nèi)發(fā)生AKI,同時(shí)存在符合共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)的脹毒癥和AKI標(biāo)準(zhǔn),可定義為SA-AKI,SA-AKI是危重患者的常見并發(fā)癥,可以使其死亡風(fēng)險(xiǎn)提高16倍[8]。近些年,新興的生物標(biāo)志物已在腎臟相關(guān)應(yīng)激和(或)損傷中顯示出巨大的開發(fā)潛力,能夠提供更多的SA-AKI病理生理情況,作為功能性檢查的重要補(bǔ)充。

SA-AKI的發(fā)病機(jī)制是多因素且復(fù)雜的,涉及炎癥、微循環(huán)功能障礙和代謝重編程之間的相互作用,其中炎癥失調(diào)尤其是NLRP3炎癥小體的異?；罨?是導(dǎo)致系統(tǒng)性炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的過度釋放、誘發(fā)一系列外周至中樞的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]、加重腎臟細(xì)胞壞死、引起全腎和局部的腎臟炎癥反應(yīng)的常見病因。NLRP3炎性小體的激活可促進(jìn)SA-AKI,且靶向NLRP3炎癥小體已被證明對(duì)急性腎損傷具有明確的治療作用。比如:通過迷迭香酸(RA)治療阻斷炎癥小體信號(hào)通路可減輕小鼠急性腎損傷[10],瑞德西韋(RDV,GS-5734)可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥小體激活和炎癥免疫反應(yīng)來改善急性腎損傷[11]。蟾蜍靈通過抑制NLRP3炎性體減輕細(xì)胞焦亡產(chǎn)生的急性腎損傷,但其在SA-AKI中的作用機(jī)制尚不明確。

本文通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)NLRP3是FOXM1的靶基因,且熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)果,確認(rèn)FOXM1可靶向調(diào)控NLRP3表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子FOXM1能夠直接或間接調(diào)控炎癥反應(yīng)過程中多種信號(hào)分子Wnt/β-catenin[12]、JAK/STAT[7]、NF-κB[13]和P38MAPK[14]、炎癥相關(guān)介質(zhì)(IL-1β、IL-6和TNF-α[15])及細(xì)胞趨化因子(MCP-1、CCL2和CX3CL1)的表達(dá)。比如,FOXM1的表達(dá)受到TNF-α/ROS/HIF-1途徑的調(diào)節(jié)[16],抑制FOXM降低了CCL11、CCL24以及趨化因子受體CCR2和CX3CR1的表達(dá),導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集減少[17]。高表達(dá)FOXM1能夠增加Th1和Th2細(xì)胞因子的分泌、促進(jìn)PI3K/AKT/GSK-33和p38MAPK信號(hào)通路所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[18]。此外,Wnt/β-catenin信號(hào)通路可誘導(dǎo)FOXM1去泛素化,穩(wěn)定FOXM1的結(jié)構(gòu)和表達(dá),從而驅(qū)動(dòng)β-catenin入核,促進(jìn)炎癥生物學(xué)行為相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。若抑制FOXM1則可以阻止細(xì)胞凋亡、炎癥、NF-κB和JAK/STAT信號(hào)通路活化的影響[19],且FOXM1與p38MAPK、NF-κB的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系,通過p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路來啟動(dòng)炎癥因子的表達(dá)、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[20],而miR-4429靶向FOXM1可以降低SMAD3的表達(dá)水平[21],阻礙細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,從而抑制炎癥進(jìn)展[22]。為進(jìn)一步確認(rèn)FOXM1在LPS誘導(dǎo)的SA-AKI模型中的表達(dá)變化,本研究采用免疫印跡分析技術(shù),結(jié)果顯示FOXM1在LPS誘導(dǎo)的SA-AKI模型中呈現(xiàn)高表達(dá)。為了更為直觀地揭示NLRP3與FOXM1二者之間的關(guān)系,本研究選用研究急性腎損傷常用的腎足細(xì)胞(MPC5)作為研究載體,在MPC5中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FOXM1干擾質(zhì)粒,通過qRT-PCR檢測干擾FOXM1后對(duì)NLRP3表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在MPC5中FOXM1的表達(dá)水平顯著升高,同時(shí),NLRP3 mRNA水平也隨之上升,且隨濃度梯度升高而上升。相反,在MPC5中FOXM1表達(dá)明顯下降,同時(shí)NLRP3 mRNA水平也隨之降低,且隨濃度梯度下降而降低。這提示NLRP3炎癥小體的激活可能通過FOXM1的特異性上調(diào)來實(shí)現(xiàn),且FOXM1與NLRP3之間存在正向調(diào)控作用。因此,推測FOXM1可能通過靶向NLRP3影響其下游炎性因子的表達(dá),進(jìn)而參與膿毒癥相關(guān)腎損傷的發(fā)生發(fā)展(圖8)。

在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型中,FOXM1通過轉(zhuǎn)錄激活NLRP3炎癥小體促進(jìn)下游炎癥因子的釋放,從而加劇膿血癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)展。

綜上所述,FOXM1在MPC5中對(duì)NLRP3基因表達(dá)具有靶向調(diào)控作用,且上調(diào)FOXM1表達(dá)后NLRP3表達(dá)增加,下調(diào)FOXM1表達(dá)后NLRP3表達(dá)隨之降低,且呈現(xiàn)出濃度梯度依賴性。因此,FOXM1、NLRP3有望成為膿毒癥相關(guān)腎損傷進(jìn)展過程中生物治療新靶點(diǎn)。然而,目前尚未明確FOXM1調(diào)控膿毒癥相關(guān)腎損傷發(fā)展是否還涉及其他因子的參與,需要進(jìn)一步研究來闡明。